Programozott sejthalál, sima felszínű endoplasmás reticulum, vesicularis transport Dr. Röhlich Pál prof. emeritus ÁOK 2012/2013 I. félév: A sejtbiológia alapjai 2011. 10. 9.

Programozott sejthalál A szervezet formálásának két oldala: sejtszaporodás ill. irányított sejthalál Példák: Sejtszaporodás és sejtpusztulás egyensúlya (sejt-homeostasis). Elöregedett, felesleges sejtek kiiktatása. Szervek, szövetek hozzáalakítása a funkcióváltáshoz (pl. emlőmirigy) Az embryonalis fejlődésben átmenetileg megjelenő szervtelepek, embryonalis strukturák leépítése. Öngyilkos program minden sejtben, mely aktiválódhat intra- vagy extracelluláris jelre: a sejt megöli magát. A programozott sejthalál két formája: Apoptosis (ez a leggyakoribb) Autophagia túlméretezett formája

Apoptosis    Mikroszkópos megjelenése A sejt zsugorodik, lekerekedik, felszíne lebenyezetté válik, a lebenyek leválnak önálló kisebb darabokra (apoptotikus testek). A sejtmag kromatinja elkülönül világos és sötét részletre (utóbbi sokszor félholdszerű a mag egyik szélén), a mag zsugorodik, töredezik (pyknosis, karyorhexis). A membránok épek maradnak. Az apoptotikus sejt felszíni molekuláris szerkezete megváltozik, ezt phagocyta sejtek felismerik, gyorsan bekebelezik a sejtet vagy apoptotikus testet és lysosomáikkal lebontják. Az apoptotikus sejt gyorsan és nyomtalanul eltűnik.  Apoptotikus sejtek FM-ban. Phagocyta (makrophag) bekebelezett apoptotikus sejtekkel és testekkel. Nyirokcsomó, FM felvétel   Apoptosis EM képe.

Apoptotikus sejtek fejlődő egérmancsban. TUNEL reakció. Az apoptosis biokémiai és citokémiai módszerekkel is felismerhető. A DNS endonukleáz enzim révén feldarabolódik a nucleosomák között, különböző hosszúságú (1, 2, 3, 4 stb. nucleosományi) DNS darabokra. Ezek kimutathatók: Gel-elektroforézissel (szabályos sávok a kül. hosszúságnak megfelelően: DNS-létra). TUNEL-reakcióval. A szétvágott DNS szabad végeire egy speciális enzim fénymikroszkópban látható jelzőanyaggal (fluorokróm) jelzett nukleotidokat épít rá, az ilyen sejt a mikroszkópban felismerhető.  A negatív töltésű foszfolipid, foszfatidilszerin a sejtmembrán belső lipidrétegéből a külsőbe helyeződik át. A sejtfelszíni foszfatidilszerin egy hozzá kötődő fehérjével (annexin V), amelyet jelzőanyaggal jelöltünk meg, mikroszkóposan láthatóvá tehető. Apoptotikus sejtek fejlődő egérmancsban. TUNEL reakció. apoptotikus sejt Zöld: annexin, vörös: mitochondrium, kék: DNS

Kaszpázok, mint az ölő mechanizmus centrális molekulái. Az apoptosis molekuláris háttere Kaszpázok, mint az ölő mechanizmus centrális molekulái. Fehérjebontó enzimek (proteázok), aktív centrumban cisztein, aszparaginsav mellett bontják a peptidláncot. Inaktívak (pro-kaszpáz), aktiválás fehérjerészlet lehasításával. Egyik kaszpáz aktiválja a következőt: kaszpáz kaszkád (a hatás felerősödik). Kezdő (Initiator) kaszpázok (kaszpáz 2, 8, 9, 10) indítják be a kaszkádot. „Kivégző” kaszpázok (kaszpáz 3, 6, 7) végzik a jel továbbítását és a sejt lebontását. A kivégző kaszpázok célpontjai: laminok a maglaminában (magburok szétesik), sejtadhéziós és sejtvázfehérjék (sejt elveszti kapcsolatát a környezettel, lekerekedik), endonukleázt gátló fehérje (endonukleáz aktiválódik és darabolja a DNS-t), szöveti transzglutamináz. (enzim, mely apoptosisban a fehérjéket keresztbeköti a lizin és glutamin aminosav között (izopeptid-kötés). A fehérjék funkcióképtelen masszává kötődnek össze). Mi indítja be az apoptosist? Külső jelek vagy azok hiánya. Pl. Fas ligand pl. az ölő lymphocyta membránjában, Fas-receptor („halál receptor”) a megölendő sejt membránjában, ehhez csatlakozik adapter fehérjéken keresztül az initiator prokaszpáz (prokaszpáz 8 vagy 10), mely fehérjebontással aktiválódik és beindítja a kaszpáz kaszkádot. Túlélési faktorok (pl. növekedési faktorok) hiánya Csak azok a sejtek maradnak életben, melyekre szükség van. Ezt a szervezet túlélési faktorokkal (kémiai jelmolekulák) hozza a célsejt tudomására. A túlélési faktorok többféle receptoron és azokhoz csatlakozó útvonalon hatnak. A faktorok hiánya a sejt halálához vezet. 

Mi szabályozza a citokróm-C kiáramlását? 2. Belső jelek. Mitochondriumból. Citokróm-C jut ki a mitochondrium intermembrán teréből a cytosolba. Itt adapterfehérjéhez (Apaf-1) kötődik, amely oligomerizálódik (apoptosoma), begyűjti a prokaszpáz 9-et (initiator k.) és aktiválja azt. Az aktivált kaszpáz 9 elindítja a kaszkádot. p53 tumorsuppressor javíthatatlan DNS-hibát észlel.  Mi szabályozza a citokróm-C kiáramlását? A Bcl2 fehérjecsalád A család néhány tagja (Bak, Bax) serkenti az apoptosist. A mitochondrium külső membránjában aggregálódva csatornát képeznek a cytochrom C (és egyéb oldható mitochondriális fehérjék) számára. Beindul a kaszpáz-kaszkád. A Bcl2 család más (anti-apoptotikus) tagjai gátolják az apoptosist azáltal, hogy gátolják a csatornaképző Bakot és Baxot. További Bcl2 fehérjék viszont az anti-apoptotikus Bcl2 fehérjéket gátolják és ezzel serkentik az apoptosist. Ez a kiegyensúlyozott reguláló rendszer az a csomópont, ahová különböző (pro- és anti-apoptotikus) jelek (DNS-károsodás, oxigén, tápanyagok, túlélési faktorok hiánya, stb.) befutnak és beindítják vagy gátolják a sejthalált.

Túlélési faktorok hiánya, és belső jelek (DNS-károsodás, oxigén- és tápanyaghiány, stb.) Külső (halálthozó) jelek mitochondriumból fehérjék kiáramlása, szabályozza a Bcl2 fehérjecsalád adapter fehérjék initiator-kaszpázok kivégző kaszpázok laminok szöveti transzglutamináz adhéziós és sejtvázfehérjék endonukleáz

Felesleges idegsejtek kiiktatása Az apoptosis elmaradása esetén: Az apoptosis jelentősége Ujjak szétválasztása Embrionális fejlődésben: blastocysta üreg kialakítása, ujjak szétválasztása, izületi rés kialakítása, ősvese nagy részének lebontása, Wolff- ill. Müller-cső visszafejlődése az ellentétes nemben, idegi kapcsolatok létrejötte (felesleges neuronok kiiktatása), stb.  Felnőtt, normális szervezetben: felesleges spermiogoniumok, oogoniumok pusztulása, tartalék neutrophil granulocyták eltávolítása csontvelőben, autoreaktív T-sejtek kiiktatása, B-sejtek elhalása antigén hiányában, faggyúmirigysejtek átalakulása, hormonfüggő mirigysejtek visszafejlődése hormon hiányában (emlőmirigy visszafejlődése szoptatási időszak után, prostatahám, endometrium, ovarium tüszői), hajhagyma sejtjei, megakaryocyták Felesleges idegsejtek kiiktatása Kóros állapotokban: neuronelhalás neurodegeneratív betegségekben, rákos sejtek pusztulása kemoterápiában, szívizomelhalás infarktus körül Az apoptosis elmaradása esetén: daganatok fejlődnek ki (DNS-károsodott sejtek továbbszaporodása, Bcl2 kóros túlprodukciója miatt), autoimmunitás alakul ki (autoreaktív lymphocyták megmaradása miatt), fejlődési rendellenességek jönnek létre (a normális szervkialakítás megzavarása miatt).

Apoptosis és necrosis Apoptosis Necrosis Öngyilkos program beindul. Sejt zsugorodik, magstruktúra változik, sejt és mag feldarabolódik, apoptotikus testek, fehérjék keresztbekötődnek, phagocyták gyorsan felismerik és bekebelezik. Gyorsan, tünetmentesen, nyomtalanul tűnik el a sejt. Necrosis Öngyilkos program nem aktiválódik, Sejt erősen károsodik, felpuffad, szétpukkad, a cytosol a károsodott organellumokkal kiáramlik és elönti a környezetet. Gyulladásos reakciót vált ki. 

Részlet luteinsejtből. Sima ER cisternák rendszere. EM kép. Sima felszínű endoplasmás reticulum (sER) ER tubulusok vagy cisternák 3D rendszere. Néhol összefügg a dER-rel. A nagy intracytoplasmatikus membránfelület számos enzim (és transzportmolekula) elhelyezésére ad lehetőséget.   Részlet retina pigmenthámsejtjéből. Sima ER tubulusok elágazó rendszere. EM kép. Részlet luteinsejtből. Sima ER cisternák rendszere. EM kép.

A sER funkciói I. Általános funkciók. Lipidszintézis. Foszfolipidek, koleszterin, triacylglycerinek szintéziséhez szükséges enzimek a sER-ben. Membrán lipid kettősrétege itt keletkezik. II. Speciális funkciók egyes sejttípusokban. Szteroidhormonok szintézise, átalakítása (p450 monooxigenázok, szteroidhormon-módosítások). Mellékvesekéreg, here Leydig-sejtjei, ovarium corpus luteum sejtjei. Méregtelenítés. (p450 monooxigenázok). Hydrophob vegyületek (melyek zsírokban felhalmozódnának, pl. xenobiotikumok, phenobarbitál) hydrophillé átalakítása. OH-csoportok felvitele, ehhez szulfát, glukuronsav is kötődik. Kiválasztható. Helye: elsősorban a májsejt. Glukóz-6-foszfatáz sER-ben lokalizálódik. Glc-6-P-ról lehasítja a foszfátot. Glukóz kijut a sejtből. Elsősorban májsejtben. Ca-tárolás. Ca-ATPáz a membránban bepumpálja a Ca-ot, ER lumenben Ca-kötő fehérjék (pl. calsequestrin). Ca-csatorna a membránban, Ca-kijutás szabályozott, fontos szerep jelátvitelben. Különleges szerep h.cs. izomban (sarcoplasmaticus reticulum). Retinál-reizomerizáció. A fotoreceptor molekula retinálja itt reizomerizálódik trans-izomerből cis-izomerbe. Szerepe a fotorecepcióban. Helye: a retina pigmenthámja, felelős molekula a membránban: p65 (izomerohidroláz).

Vesicularis transport Anyagtovábbítás membránnal határolt kompartimentumok között. Jelentősége. vesicula lefűződése tanszport vesicula fúziója donor kompartimentum cél-kompartimentum Megoldandó feladatok: szelektivitás: csak bizonyos fehérjéket vihet át, válogat csak a cél-kompartimentum membránjával fúzionálhat a donor kompartimentum identitása nem változhat A cél-kompartimentumba átvitt anyagok: membrándarab (membránfehérjékkel) és oldékony molekulák a vesicula belső terében (lumenében). 1. A vesicula bimbózása a cytosol felé, burok kialakulása A burok kettős szerepe: 1. összegyüjti a szállítandó fehérjéket, és 2. kikényszeríti a membrán vesiculává görbülését A clathrin burok: építőeleme: triskelion, ötszögekből és hatszögekből álló gömbölyded kosárszerkezetté áll össze. A clathrin és a szállító receptor között egy adapter fehérje létesít kapcsolatot. adapter szállító receptor clathrin lecsípődés dynaminnal triskelion clathrin „kosár” a vesicula bimbózása és a szállítandó molekulák befogása clathrin-burokkal 

A COP-burok többféle fehérjealegységből (coatomerekből) áll össze A COP-burok többféle fehérjealegységből (coatomerekből) áll össze. A burok kialakulása egy aktivált kis G-fehérjének (sar1 ill. Arf) a membránba horgonyzódásával kezdődik, ez gyűjti maga köré a coatomereket. A membrán görbülni kezd. A burokalegységek kötőhelyeikkel transzmembrán fehérjéket gyűjtenek be, ezzel megindul a szállítandó fehérjék kiválogatása. A COPI- és COPII burok hasonló elvek szerint épül fel, de más szállítandó fehérjéket kötnek, és egymáshoz képest ellenkező irányban szállítanak.  

2. A vesicula vándorlása. A burok leválik, a vesicula rövid távon diffúzióval, hosszabb távon a sejtváz mikrotubulusai v. filamentumai mentén motor molekulákkal továbbítódik a cél-kompartimentum felé. 3. A vesicula kihorgonyzása a cél-kompartimentumon és fúziója. A célmembrán felismerése molekuláris felismerő mechanizmussal történik. A vesicula membránján v-SNARE, a célmembránon t-SNARE (integráns membránfehérjék) kapcsolódik egymáshoz. A felismerést segítik: Rab-fehérjék (kis G-fehérjék, specifikusak a különböző kompartimentumokra) és azokhoz társuló egyéb fehérjék. A fúzió: a v- és t-SNARE fonálszerű részei összecsavarodnak és összehúzzák a két membránt. A vízmolekulák a két membrán közül kizáródnak, a két lipid kettősréteg összefekszik, lipidek átrendeződnek, átszakadás. A v- és t-SNARE szétválasztása a fúzió után: NSF fehérje segítségével. A fúzió szabályozása pl. synaptikus vesiculák fúziójánál: egy gátló fehérje eltávolítása

Differenciálódás Sejtek strukturális és funkcionális specializálódása, melynek révén meghatározott és komplex feladatokat képesek elvégezni. Ehhez új fehérjék expressziójára, mások letiltására van szükség. A sejtek alakja, belső strukturája és ezekkel együtt működése is megváltozik. Példák: idegsejt, harántcsikolt izomrost. Meghatározott gének be- ill. kikapcsolása, alapvetően génregulációs folyamat. Gyakran többlépcsős szabályozási folyamat („master gének”, ezek további géneket aktiválnak, kaszkád, pl. myoD az izomdifferenciálódásban). Gyakran a szervezet más sejtjei indítják be (jelmolekulák kibocsátásával, pl. differenciálódási és növekedési faktorokkal, amelyek a célsejt receptoraihoz kötődve jelátviteli útvonalat aktiválnak, amely elérve a sejtmag DNS-ét azon meghatározott géneket szabályoz). Egyetlen génregulációs fehérje egy egész szerv kialakulását képes kiváltani (pl. a szem fejlődését mind Drosophilában, mind emlősökben, Eye ill. pax-6 melyek további géneket regulálnak, l. fejlődéstan). A fejlődési lehetőségek (potenciák) a differenciálódás alatt beszűkülnek. Omnipotens, pluripotens, multipotens und unipotens sejtek kialakulása a fejlődés során. Dedifferenciáció, transzdifferenciáció. Sejtosztódás és differenciálódás: 1. Bizonyos sejttípusok (pl. máj és vesehámsejtek) osztódhatnak elhalt sejtek pótlására, ugyanakkor megőrzik differenciált jellegzetességeiket. 2. Más sejttípusok olyan mértékben differenciáltak (végdifferenciálódás), hogy teljesen elvesztik osztódási képességüket. Ezek csak szövetspecifikus őssejtek osztódása és a keletkező sejtpopuláció differenciálódása révén pótolhatók (pl. vérsejtek, bőrhámsejtek). 3. Egyes végdifferenciált sejtek (pl. idegsejtek, szívizomsejtek) egyáltalán nem pótolhatók. Differenciált sejtek elsősorban a sejtciklus G0 fázisában vannak.

Őssejtek kevéssé differenciált pluripotens sejtek (többféle lehetséges differenciálódási iránnyal) Tulajdonságaik: ritkán osztódnak (alacsony osztódási ráta) osztódási képességük korlátlan (önmegújítás, kimeríthetetlen sejttartalék), pluripotens sejtek (több lehetséges differenciálódási irány) aszimmetrikus osztódások (az egyik leánysejt őssejt marad, a másik gyakori osztódásokkal gyorsan szaporodó, majd differenciálódó sejtpopulációt alkot). Embrionális őssejtek (ESC): korai humán csírából származó és sejttenyészetben fenntartott sejtek (pl. in vitro megtermékenyítés során kapott számfeletti csírából). Különböző hatóanyagokkal meghatározott irányban differenciáltathatók. Remények elhalt differenciált sejtek pótlására degeneratív betegségekben. Etikai problémák. Felnőtt őssejtek. Különböző kialakult szövetek ún. szöveti fészkeiben (niche) fennmaradó, nem, vagy kevéssé differenciált sejtek. Specifikus hatásokra osztódhatnak és differenciálódnak. A szövetspecifikus differenciálódás mellett más szöveti típusokká is differenciáltathatók (pl. bőrhámsejtből májsejt, vagy csontvelői őssejtből retinális ill. szívizomsejtek képezhetők). Közti megoldás: A sejtmagjától megfosztott petesejtbe felnőtt differenciált sejt magja ültethető. A kifejlődő csíra sejtjeiből embryonalis őssejtek nyerhetők. Előnyei.

Őssejtek és sejtosztódás progenitorsejt (elkötelezett) Sejtszaporodás egymást követő osztódásokkal („transit-amplifying cells”) végdifferenciált sejtek 

Felhasznált illusztrációk forrása:  Röhlich: Szövettan, 3. kiadás, Semmelweis Kiadó Budapest  Alberts – Johnson – Lewis – Raff – Roberts – Walter: Molecular biology of the cell. 5. kiadás, Garland Science  Saját prep. és/vagy felvétel, ill. rajz