Molekuláris biológiai módszerek

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
KŐVIRÁG 6.
Advertisements

“Valós idejű” polimeráz láncreakció (RT-PCR)
Delta Bio 2000 Kft. Ügyvezető: Dr. Haracska Lajos
ENZIMOLÓGIA 2010.
A polimeráz láncreakció Gurbi Bianka március 4. Emelt Biotechnológiai Számítások.
DNS replikáció Szükséges funkciók Iniciáció
Az enzimek A kémiai reakciók mindig a szabadenergia csökkenés irányába mennek végbe. Miért nem alakul át minden anyag a számára legalacsonyabb energiájú,
Elektroforézis Általában agaróz a hordozó
Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor.
Fehérjeszintézis Szakaszai Transzkripció (átírás)
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
Eddig csak kvali volt... Kvantitatív proteomika 1) a frakcionálás szintjén Pl. 2D gélek összehasonlítása vizuálisan, komputer programokkal, differenciál.
Tömegspektroszkópia (MS = mass spectrometry)
Strukturális genomika Gyakorlati feladatok. SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?
Bioinformatika Dr. Miskei Márton Tudományos munkatárs.
Kémiai BSc Szerves kémiai alapok
Az élő szervezeteket felépítő anyagok
Molekuláris genetika Falus András.
Kapilláris elektroforézis
Polimeráz láncreakció (PCR)
MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI
GTPáz aktivitás mérése gyakorlat Lévay Magdolna
ENZIMEK Def: katalizátorok, a reakciók (biokémiai) sebességét növelik
Géntechnikák Laboratórium
2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények.
Monoklonális antitestek gyártása
DNS amplifikáció pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van
FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ
Kalmár Dániel DP51IG Budapesti Műszaki- és Gazdaságtudományi Egyetem Fizikai Kémiai és Anyagtudományi Tanszék
Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése
A gélelektroforézis Alkalmazása: különböző molekulák (nukleinsavak, fehérjék) -méret szerinti elválasztását, -detektálását -mennyiségének meghatározását.
AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE. AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT Könnyű lánc (L) Nehéz.
Nukleinsavak és a fehérjék bioszintézise
Koaguláció. Kolloid részecske és elektrosztatikus mezője Nyírási sík (shear plane): ezen belül a víz a részecskével együtt mozog Zéta-potenciál: a nyírási.
Citromsav, Nátrium-acetát és szőlőcukor azonosítása
ELVÁLASZTÁSTECHNIKA 1.
Természetes szénvegyületek
Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás
IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László.
PREPARATÍV TECHNIKÁK Félmikro- mikro technikák Inert technikák
Készítette: Czigléczki Gábor
Molekuláris rátermettség tájképek Kun Ádám. Rátermettség tájkép  Minden genotípushoz rendeljünk egy fenotípust  Minden fenotípushoz rendeljünk egy valósz.
Humán Genom szekvencia és variabilitás
A Föld vízkészlete.
Fehérjeszekvenálás Mikronalalitikai kurzus fehérjeszekvenálás.
Molekuláris klónozás a gyakorlatban. CRISPR/Cas rendszerek Adaptív bakteriális immunitás Idegen nukleinsavak ellen ( pl. vírusok) Ezek integrálása a genomba,
DNS szintézis, replikáció Információ hordozó szerep bizonyítéka Avery-Grifith kísérlet Bakterifágos kísérlet.
30. Lecke Az anyagcsere általános jellemzői
Primer tervezés qPCR-hez
Új molekuláris biológiai módszerek
Molekuláris biológiai módszerek
Polyacrylamid-Gél Elektroforézis (PAGE)
KÓRHÁZI ACINETOBACTER BAUMANNII TÖRZSEK JELLEMZÉSE
A GFP in vitro génexpressziója
Új molekuláris biológiai módszerek labor
Új molekuláris biológiai módszerek
Új molekuláris biológiai módszerek
Proteomika, avagy a fehérjék „játéka”
Molekuláris biológiai módszerek
Új molekuláris biológiai módszerek
Molekuláris biológiai módszerek
Győri Edit Lelle Kocsis Kinga
ENZIMOLÓGIA.
A DNS replikációja Makó Katalin.
Készítette:Tóth Karolina
Új molekuláris biológiai módszerek
Új molekuláris biológiai módszerek
Biotechnológia, génmanipulációk, transzgenikus élőlények
Előadás másolata:

Molekuláris biológiai módszerek Szekvencia-analízis

Sanger és Coulson: +/- szekvenálás Maxam és Gilbert: Kémiai hasítás Sanger: Lánctermináció http://www.ppdictionary.com/tutorials/sanger.htm

Előkövetelmények Különlegesen tiszta templát DNS (0,6-6μg): DNS polimerázt ne gátolják, só eliminálása, kis fragmentek eliminálása. CsCl gradiens, oszlpkromatográfia, PEG (0,8 M NaCl, 6,5% PEG 8000) dsDNS denaturálás (ssDNS): NaOH kezelés, fenolozás, alkoholos kicsapás Melegítés, majd gyors hűtés

GC-gazdag szakaszok: másodlagos szerkezet Alternatívák: PCR-rel szaporított templát alternatív nukleotidokkal

Polimeráz reakció Denaturált templát DNS + szekvenáló primer 65°C, 2 perc, lassú hűtés RT. Reakció puffer: 40 mM Tris pH: 7,5 , 20 mM MgCl2, 25 mM NaCl (10% DMSO) Szekvenáz enzim : módosított T7 polimeráz (+ élesztő pirofoszfatáz) dNTP-k amiből az egyik (legalább részben) jelölt ddNTP/dNTP mixek Formamidos leállító puffer

Szekvenálás hőstabil polimerázzal (Taq) Előnyei: Specifikusabb primer-feltapadás Kevésbé akadályoz a másodlagos struktúra Hátrányai: 5’→3’ exo., ddNTP-k iránti affinitás igen pici Genetikailag manipulált változatok: G46D, vagy 1-278 deletált: Nincs 5’→3’ exo. F667Y: ddNTP és fluorescensen jelöltek is Ciklikus szekvenálás lehetősége: Lineáris növekedés, erősebb jel

Szekvenáló gél 0,2-0,5 mm vékony mosás, szilán (CH3-SiCl2-CH3) csipesz 4-10% akrilamid/biszakrilamid 1xTBE (pH: 8,3) 7M Urea (20 % Formamid) 55ºC, RT, keverés szűrés, vákuum APS, TEMED (jég) Cápafog fésű

Futtatás 1XTBE Alapos mosás, buborékok Előfuttatás (~45’): hőmérséklet (45-50ºC), ekvilibrium 1-5µl minta 2000-3000 Volt Új loadolás a lefutás után 15 perccel: hosszabb rész Gél fixálás: 10% MetOH, 10% ecetsav Szárítás: papír, műanyag fólia, vákuum Előhívás: Röntgen film, 14-24 óra, -80ºC

Automatizált szekvenálás 96 és 384 well plates Fluorescens jelölések: Primert, vagy ddNTP-t Energia transzfer: 1 féle gerjesztő, 4 féle emittáló, 5 nukleotid távolság, vagy linkerrel („big dye”) Dye-terminátor: nem kell specifikus primer Módosított, fluorescensen jelölt ddNTP-ket felismerő enzimek Kapilláris elfo., robotok: Nagy mintaszám Genomok szekvenálása: Kromoszóma séta és shotgun

fenilizotiocianát fenilhidantoin aminosav Edman-degradáció

relatív gyakoriság (%) sejtek fehérjék elektro- forézis emésztés peptidekké oszlopkromatográfia peptid mix. ionizáció még kisebb 1. analízis 2. analízis semleges gáz ütköztetés újabb fragmentáció frag- mentek peptid- ionok peptid szekvencia relatív gyakoriság (%) MS spektrum MS/MS spektrum tömeg/töltés Protein szekvenálása tömegspektrométerrel jelrögzítés