OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2016 Fluoreszcens jelzőanyagok (KM), szept.21. Fotokróm anyagok (BP), szept. 28. 3. Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), okt. 5. 4. Fotodinámiás terápia (VT), okt. 12. 5. Fluoreszcenciás képalkotó eljárások (VT), okt. 19. 6. Közeli infravörös spektroszkópia és mikroszkópia (GSz), okt. 26. 7. Királis anyagok optikai spektroszkópiája (KM), nov. 2.

ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni) Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

Jablonski-diagram

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

Fluoreszcens festékpróbák Cél: a mikrokörnyezet jellemzése a fluoreszcencia sáv J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999

Vázlat  Műszerek stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása  Polaritás szenzorok  Viszkozitás szenzorok  Fehérjék fluoreszcenciája / triptofán Távolságmérés: FRET

Spektrofluoriméterek stacionárius időfelbontásos (F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)

Stacionárius

Gerjesztési és emissziós spektrum Gerjesztési sp: hasonlít az abszorpciósra, S0 →S1, S0 →S2, ∙∙∙ átmenetek sávjai Emissziós sp: csak S1 →S0, IF készülékfüggő!

Fluoreszcencia kvantumhatásfok F meghatározása - integráló gömbbel - standarddal X: minta R: standard IX,IR a fluoreszcenciasávok integrált intenzitása AX, AR abszorbanciák a gerjesztés hullámhosszán nX, nR törésmutatók

Időkorrelált egyfoton-számlálás

Fluoreszcencia lecsengési görbe IRF

Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása

Na+ indikátor CoroNa Green

Na+ ionok eloszlása idegsejtben, Na+ indikátor Na+ ionok eloszlása idegsejtben, mikroszkópos kép CoroNa Green alkalmazásával, W. J. Tyler et al. , PlosOne 3, e3511 (2008)

Gerjesztési spektrumot mérnek, ott max eltolódik Na+ indikátor SBFI Gerjesztési spektrumot mérnek, ott max eltolódik Szelektív: a Na+ a K+ mellett is mérhető SBFI = sodium-binding benzofuran isophthalate

Na+ indikátor SBFI-vel festett idegsejt

Klorid indikátor MQAE Szelektív: nitrát, foszfát nem oltják ki, Br-, I- igen Működése dinamikus kioltáson alapszik

Klorid indikátor Kloridion eloszlás idegsejtekben IF kép FLIM: fluorescence lifetime imaging

Dinamikus kioltás: Stern-Volmer egyenlet M + h M + h M +  M* M + Q

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval

Stern-Volmer egyenlet

Polaritás szenzorok nílus vörös water, - methanol - ethanol - acetonitrile - dimethylformamide, 6. acetone - ethyl acetate - dichloromethane - n-hexane - methyl-tert-butylether - cyclohexane - toluene.

Szolvatoktromizmus: a szín függ az oldószertől

Algasejtből nyert lipid testecskék rendeződése A sejtmembrán sérülése után új sejtek képződnek A minta nílus vörössel festve: a membrán (lipid) sárga Kim G H et al. J Cell Sci 2001;114:2009-2014

„charge transfer (CT)” festékek Oldószer polaritás

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet + _ - - - - + + + + 2a G v. E

Lippert-egyenlet - - - - + G v. E _ + + + + 2a

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása etanol-víz oldószerelegy Lakowicz, p. 191

Viszkozitás szenzor

Festékmolekula orientációs relaxációja (rotációs diffuzió) Stokes-Einstein-Debye egyenlet f alaktényező (gömbalakra f = 1) C súrlódási tényező (0<C<1, ha a részecske nagy az oldószermolekulákhoz képest C ~ 1) környezet viszkozitása VM molekula térfogat T hőmérséklet k Boltzmann állandó

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

or mérése: a fluoreszcencia depolarizáció időfüggését mérjük

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

Kettős fluoreszcencia: twisted intramoleculat charge transfer = TICT DMANCN fl. színképe etilénglikolban, a két sáv int. aránya viszkozitásfüggő Lakowicz, p. 201

Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, pH 7) Lakowicz, p. 446

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára Apoazurin Pfl T1 ribonuclease staphillococcus nuclease glucagon Lakowicz p. 453

Lakowicz, p. 461

Lakowicz, p. 461

Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV-fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r6-nal arányos

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

Akceptor Donor: EtBr (etidium bromid)

BODIPY fluoreszcencia EtBr abszorpció

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni