AZ ANTIGÉN-FELISMERŐ RECEPTOR VARIABILITÁSÁNAK GENETIKAI HÁTTERE

Egy egyénben elérhető antitest specificitások száma, azaz az antitest repertoár legalább 10 11, illetve még ennél is több lehet DE csak kb fehérje kódoló gén van az emberben. Antitest diverzitás genetikai háttere

Csíravonal elmélet (Külön gén minden különböző antitestnek) V2V2V2V2 C2C2C2C2 VnVnVnVn CnCnCnCn V1V1V1V1 C1C1C1C1 1 GÉN Szomatikus változatosság elmélet (a V-régióban magas a szomatikus mutációk aránya) VC GénGénGénGén Fehérje 1 GÉN = 1 FEHÉRJE A molekuláris biológia dogmája Immunglobulin szekvenciák tulajdonságai ELMÉLETEK

Az immunglobulinok molekuláris genetikája a CSÍRAVONALBAN egyetlen C régió gén van kódolva, elkülönítve a V régió génektől többféle V régió gén van van egy mechanizmus, mely átrendezi a V és C géneket a genomban, tehát azok képesek összekapcsolódva egy egész immunglobulin gént létrehozni. 1965, Dreyer & Bennett feltételezték, hogy: Hogyan lehet genetikailag megmagyarázni az antitestek kettős funkcióját? Ez genetikai eretnekség volt, mivel megsértette az akkoriban elfogadott elképzelést, miszerint a DNS egy egyén minden sejtjében azonos

A Dreyer - Bennett hipotézis V V V V V V V V V V V V V Egy mechanizmus létezik, mely átrendezi a V és C géneket a genomban, tehát azok képesek összekapcsolódva egy egész immunglobulin gént létrehozni. C V C A csíravonalban egyetlen C régió gén kódolva, elkülönítve a V régió génektől Cél: A többféle V gén létezésének, valamint a C génhez történő átrendeződés kimutatása

Eszközök: cDNS próbák a V és C régiók elkülönítésére C V V V V V V V V V Csíravonal DNS Csíravonal (pl.: placenta) és átrendezett B sejt DNS (pl.: myeloma B sejtből) DNS restrikciós enzimek a DNS feldarabolásához C V V V V V Átrendezett DNS Megközelítés

C V V V V V C V V V V V Méret szerinti elválasztás gél elektroforézissel VV VV C V Blottolás V régió próbával Blottolás C régió próbával Myeloma B sejtek DNS-ének feldarabolása restrikciós enzimekkel V és C próbák ugyanazokat a fragmenteket mutatják ki, némelyik V régió hiányzik, a C fragment nagyobb a csíravonal DNS-hez viszonyítva VV VV C V Bizonyíték a gén rekombinációra VVV Blotttolás V régió próbával Blottolás C régió próbával C VV VV VV Méret szerinti elválasztás gél elektroforézissel Csíravonal DNS

Több variábilis gén, de csak egy konstans gén van VCVVVCSÍRAVONAL V és C gének csak a B sejtekben kerülnek közel egymáshoz C V VV B-SEJT Következtetés FEHÉRJE GÉN Génszegmensek átrendezése egyetlen működőképes egységgé (génné)

A génátrendeződés koncepciója Csíravonal szerkezet A génszegmenseknek össze kell épülniük az expresszióhoz Meghatározott sorrendben történik A csontvelőben, a B-sejt prekurzorokban történik (soma) A sokféleség forrása még az antigén expozíció ELŐTT

Ig gén megszekvenálása komplexebbé tette a modellt A csíravonal V L gének struktúrája hasonló volt V ,és V, génekéhez, habár egy anomália volt a csíravonal és az átrendezett DNS között: Honnan jön az extra 13 aminosav? CLCL VLVL ~ 95 aa~ 100 aa L CLCL VLVL ~ 95 aa~ 100 aa JLJL Az extra aminosavakat egy kis régió, a J vagy JOINING régió adja L CLCL VLVL ~ 208 aa L

A csíravonal humán immunglobulin könnyű lánc lókuszok elhelyezkedése

Figure 2-15 part 1 of 2 J-joining CDR1 és CDR2 CDR3

B-lymphocyta fejlődés alatt JkJκJκJκJκJκJκVκVκVκVκVκVκ B-sejt 1 JκJκVκVκ B-sejt 2 35 Vκ 5 Jκ5 Jκ5 Jκ5 Jκ VκVκVκVκVκVκVκVκ JκJκ JκJκ JκJκ JκJκ Csíravonal A kappa (κ) lánc génszegmensek átrendezése DNS

pA CCκCCκ E JJ Vκ-JκVκ-Jκ VκVκVκVκ P CCκCCκ JVκVκFehérje mRNS CCκCCκ JVκVκ AAAA Transzláció A kappa lánc kifejeződése Primer RNS transzkript CCκCCκ E JJVκVκ Leader

A fejlődő B sejtekben az immunglobulin gének strukturális változásokon (átrendeződés) mennek át, ami lehetővé teszi a kifejeződésüket. Az immunglobulin könnyű lánc V doménjét két (egy V és egy J) génszegmens kódolja, amelyek rekombináció révén kerülnek egymás közelébe.

További átrendeződés az Ig nehéz láncban VLVL JLJL CLCL L CHCH VHVH JHJH DHDH L Nehéz lánc: 0- 8 további aminosav a J H és C H között A D vagy DIVERSITY régió Minden könnyűlánc egy rekombinációt igényel: V L to J L Minden nehézlánc két rekombinációs eseményt igényel: D H to J H és V H to D H J H

A nehéz lánc V régiók három génszegmensből állnak

A humán immunglobulin nehézlánc lókuszok csíravonalbeli elrendeződése *

B-sejt fejlődés közben VH2 JH 40 VH 6 JH VH1VH3 DJH 23 D DDD JH DD A NEHÉZLÁNC GÉNSZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE DD VH1VH2VH3 VH1VH2

Az immunglobulin nehéz lánc V doménjét három (egy V, egy D és egy J) génszegmens kódolja, amelyek rekombináció révén kerülnek egymás közelébe.

Az emberi könnyű és nehézlánc, variábilis és konstans régiókat felépíteni képes, funkcionális génszegmensek száma

VH D JH VLJL V-Domének C-Domének VH-D-JH VL-JL B-sejt antigén receptorok és antitestek változatossága Egyének B sejtjei

Becsült kombinatorikai változatosság Figyelembe véve a V, D és J géneket: 46 VH x 23 D x 6JH = kombináció 38 V  x 5 J  = 190 kombináció 33 V  x 5 J = 165 kombináció = 355 különböző könnyűlánc Ha H és L láncok random alkotnak párokat, mint a H 2 L x 355 = lehetőség Csak a KOMBINATORIKAI változatosság miatt Gyakorlatban, néhány H + L kombináció nem jöhet létre, instabilitásuk miatt. Bizonyos V és J gének használata gyakoribb,mint másoké.

Hogyan működik a szomatikus génátrendeződés (rekombináció)? 1.Hogy lehet,hogy véges mennyiségű DNS-ből végtelenül változatos specificitás generálódik? Kombinatorikai sokszínűség 2.Hogyan találja meg a V régió a J régiót és miért nem a C régióval kapcsolódik? -Speciális - Rekombinációs Szignál Szekvenciák (RSS) - Rekombinációt Aktiváló Gének által kódolt fehérjék (RAGs) felismerik szabály

V, D, J határoló szekvenciák V A V, D és J elemek környezetének szekvenálása azonosított négy konzervált szekvenciát, amelyek 7, 23, 9 és 12 nukleotid hosszúságúak, és amelyeknek a sorrendje a lókusztól függ VV JJ J D VHVH JHJH 7 9

Rekombinációs szignál szekvenciák (RSS) SZABÁLY – Egy 23 nukleotid hosszúságú RSS –sel határolt génszegmens, csak egy 12 nukleotid hosszúságú RSS –sel határolt szegmenshez kötődhet VHVH D JHJH HEPTAMER – Mindig kódoló szekvenciával határos NONAMER – A heptamertől egy 12 vagy 23 nukleotid spacer választja el VHVH D JHJH 

23-mer = két fordulat 12-mer = egy fordulat szabály molekuláris magyarázata Bármilyen hosszúságú közbeeső DNS 23 V DJ7 9

23-mer 12-mer A közbülső DNS –ek hurka kivágódik Heptamerek és nonamerek egymáshoz illeszkednek Az RSS-ek által kialakított forma a rekombinázok célpontjaként szolgál V1 V2 V3V4 V8 V7 V6 V5 V9 DJ V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V9 Ilyen megfelelő forma nem hozható létre, ha két 23 nukleotid hosszúságú RSS határolja az összekapcsolandó elemeket (12-23 szabály) szabály molekuláris magyarázata

A variábilis régiókat kódoló génszegmensek, a rekombinációs szignálszekvenciáknál, rekombinációval kapcsolódnak

23-mer 12-mer V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V A rekombináció következményei P-nukleotidok képzése P-nukleotidok képzése

23-mer 12-mer A közbeeső DNS hurok kivágódik V1 DJ V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V Terminális deoxinukleotidil Transzferáz (TdT) -nukleotidok képződése N-nukleotidok képződése Kapcsolódási változatosság 6 nagyságrenddel növeli a diverzitást

Az immunglobulinok variábilis doménjein belül hipervariábilis és framework régiók vannak A könnyűláncban a CDR3, az átrendezett V és J szegmensek közötti kapcsolódás helyén található A nehézláncban, a CDR3-at a D szegmensek, valamint az átrendeződött V és J szegmensek egy-egy szakasza alkotja

Hogyan működik a szomatikus génátrendeződés? 1.Hogy lehet,hogy véges mennyiségű DNS-ből végtelenül változatos specificitás generálódik? Kombinatorikai sokszínűség 2.Hogyan találja meg a V régió a J régiót és miért nem a C régióhoz kapcsolódik? szabály 3.Hogy törik el és kapcsolódik újra a DNS? Pontatlanul, nukleotidok eltávolításával és hozzáadásával, ezzel tovább növelve a diverzitást Kapcsolódási diverzitás (P- and N- nukleotidok)