Elektromágneses spektrum

Tartalom I.Kvantumfizika - alapjelenségek 1.Fekete test hőmérsékleti sugárzása 2.Foton hipotézis II.Atomspektrumok, molekulaspektrumok 1.A hidrogén atom színképe 2.Atomspektrumok 3.Molekulaspektrumok 4.Elektronállapotok közötti átmenetek III. Elektromágneses spektrum 1.Az elektromágneses spektrum tartományai 2.Emissziós, abszorpciós spektrum 3.Spektrométerek

Tartalom IV.Abszorpciós fotometria 1.Atomabszorpciós spektrofotometria 2.Abszorpciós molekula spektroszkópia 3.Fotodinamikus hatás V. Lumineszcencia 1.Fluorimetria 2.Fluoreszcenciás mérési módszerek

I/1. A fekete test hőmérsékleti sugárzásának értelmezése Kirchoff-törvénye: Egy test e emisszóképességének és a abszorpcióképességének hányadosa állandó:e(,T)/a(,T) = E(,T) Stefan-Boltzmann törvény Wien-féle eltolódási törvény Planck-féle sugárzási törvény: A fekete test sugárzást elemi (atomi) oszcillátorok adják. Ezek az oszcillátorok azonban nem vehetnek fel tetszőleges energiát, csak meghatározott diszkrét energiával rendelkezhetnek. A Planck-féle sugárzási formula: l : hullámhossz c 1, c 2 : állandók T : hőmérséklet

I/2. További kvantumos jelenségek Fényelektromos hatás (kísérleti eredmények): Fény hatására elektronok léphetnek ki egyes fémek felületéről. A kilépő elektronok sebessége csak a fény hullámhosszától függ, a fényintenzitásától nem. A fény intenzitásának növelésével nő a kilépő elektronok száma. Magyarázat (Einstein): A fény kvantumos természetű, fotonhipotézis. Franck-Hertz kísérlet: Az atomok csak jól meghatározott méretű energia adagokat vesznek fel az elektronokkal való ütközés során (gerjesztés).

II/1. A hidrogén atom színképe A hidrogén színképe jól elkülönülő vonal sorozatokból áll. Modell: elektron hiperbolikus potenciálvölgyben. A modell jól visszaadja a már korábban kísérletezéssel megtalált formulát a hidrogén színképében lévő vonalakra. Csak meghatározott energiájú fotonokat abszorbál. R H = 3,3*10 15 s -1 : a H atom Rydberg-állandója n = 1, 2, 3, … ; k = 2, 3, … : természetes számok

II/2. Atomspektrumok Vegyértékelektron-modell: A hidrogénszerű ionok (He +, Li ++, Be +++,stb.), és alkálifémek (Li, Na, K, stb.) spektruma, a „világító elektron”-modell. Többelektronos atomok: A spektrumot a Schrödinger-egyenlet megoldásával kaphatnánk. Ez azonban csak közelítő modellek alapján lehetséges. Finomszerkezet: A spektrumban finomszerkezet figyelhető meg, a Bohr- Sommerfeld atommodell magyarázza (mellékkvantumszám bevezetése). Hiperfinom szerkezet: elektron-mag csatolás, (esetleg izotópok miatt)

II/3. Molekulaspektrumok Komplex molekulaszerkezet – komplex spektrum. A molekula energiaszintjei három különböző energiatartományba eső tag összegétől függenek (Born-Oppenheimer közelítés): Elektronkonfiguráció – közeli infravörös, látható, ultraibolya Magok rezgése egyensúlyi helyzetük körül – infravörös modell : parabolikus potenciálvölgy Molekula forgása – távoli infravörös, mikrohullám

II/4. Elektronállapotok közötti átmenetek Energia átmenetek: abszorpció termikus relaxáció fluoreszcencia sugárzás nélküli (rendszerek közötti) átmenet foszforeszencia S 0 : alapállapot S 1 -S 2 : gerjesztett (szigulett) állapotok T 1 : első triplett állapot Jablonski-diagram: molekula energiaszint rendszere – elektron gerjesztési energiaszintjei a molekula vibrációs szintjeivel

II/4. Elektronállapotok közötti átmenetek Abszorpció: legalsó vibrációs szintről Fluoreszcencia: első gerjesztett szingulett állapot (Kasha- szabály) legalsó vibrációs szintjéről  Eltolódás figyelhető meg az emisszió és abszorpció energia- szintjei között (Stokes-féle eltolódás). Tükörkép szabály: abszorpció és emisszió spektruma általában tükörszimmetrikus

Összegzés Ha egy anyag bizonyos hullámhosszú fotont bocsát ki, akkor ugyanazt el is tudja nyelni. => Egy adott anyagra jellemző a színképe. A fény kvantumos természete, foton. Az atomokban, molekulákban lévő elektronok energiaszintjei diszkrétek. Az energiaszintek között átmenetek lehetségesek – pl. megfelelő energiájú foton elnyelésével vagy kibocsátásával. Molekulák energiaszintjei függenek a vibrációs és rotációs energiától is.

III. Elektromágneses spektrum A fényintenzitás, vagy azzal arányos, analóg mennyiség a frekvencia, hullámhossz, vagy energia függvényében.

III/1. Az elektromágneses spektrum tartományai HullámhosszMegnevezésEredet/Hatás <0,1 nm  -sugárzás Magenergia átmenetek 0,1-1 nmkemény röntgenBelső elektronhéjak 1-10 nmlágy röntgenKülső elektronhéjak nmultraibolyaElektronátmenetek külső pályákon nmlátható fény 0,7-400  m infravörösForgási, rezgési átmenetek 0,4-250 mmmikrohullámokElektronspin orientáció >250 mmrádióhullámokMag mágneses momentum

III/2. Emissziós, abszorpciós spektrum Emissziós spektrum: Gerjesztett atomok által kibocsátott spektrum. Maga a minta a fényforrás. Abszorpciós spektrum: Fényelnyelődés a mintában. Vonalas spektrum keletkezése: Emisszió esetében a kibocsátott, abszorpció esetében az elnyelt foton energiája megegyezik az adott elem vagy molekula két energiaszintjének különbségével:

III/3. Spektrométerek Cél: a minta által adott hullámhosszúságon elnyelt, kibocsátott fény intenzitásának mérése. Emissziós üzemű spektrométer: Abszorpciós üzemű spektrométer:

IV. Abszorpciós fotometria Fény-anyag kölcsönhatás I 0 : beeső fény intenzitása I T : transzmittált (áteresztett) fény intenzitása I A : abszorbeált (elnyelt) fény intenzitása I R : reflektált (visszavert) fény intenzitása Transzmisszió: Optikai denzitás:

IV. Abszorpciós fotometria Fényelnyelés anyagban Lambert-törvénye: A fény az anyagon való áthaladás közben veszít intenzitásából. Az intenzitás csökkenés (  I) arányos az intenzitással(I) és az anyagban megtett út hosszával (  x). k( ) : abszorpciós együttható, anyagi minőségtől és a fény hullámhosszától függ I 0 : beeső fény kezdeti intenzitása

IV. Abszorpciós fotometria Beer-Lambert-törvény: Az abszorpciós együttható arányos a mintában lévő abszorbeáló anyag koncentrációjával. k( ) –ból meghatározható az elnyelő anyag koncentrációja. Oldatok összetételének mérésére a Lambert-törvény alakja:  ( ) : moláris extinkciós koefficiens, függ a hullámhossztól, hőmérséklettől, nyomástól, anyagi minőségtől c : koncentráció l : rétegvastagság

IV. Abszorpciós fotometria Beer-Lambert-törvény érvényességének feltételei monokromatikus mérőfény kémiailag egynemű oldat oldószer nem módosítja a minta abszorpcióját a minta nem szórja a mérőfényt és nem fluoreszkál Gyakorlati problémák kifehéredés: indukált emisszió – gerjesztett molekula ütközés során gerjesztési energiáját elveszíti, újabb foton keletkezik (nagy intenzitású fényforrás esetén jelentős) „stray light effect”: abszorbancia és koncentráció nem egyenesen arányos – a monokromátorból felharmónikusok is távoznak

IV. Abszorpciós fotometria Fény behatolási mélysége a bőrbe erősen hullámhosszfüggő, legnagyobb az infravörös tartományban.

IV/1. Atomabszorpciós spektrofotometria Alapelvek A mintát előzetesen atomizálni kell. (pl. láng) A keresett atomra jellemző hullámhosszúságú fénnyel gerjesztjük a mintát – rezonancia módszer. (hullámhossz kiválasztása pl. monokromátorral) Az elnyelt fény intenzitása arányos az abszorpcióra képes atomok számával => koncentráció számítható. Felhasználás: Alkotó elemek kimutatása. Alkotó elemek mennyiségi meghatározása.

IV/1. Atomabszorpciós spektrofotometria Eredmények: A módszerrel nagyon sok elem vizsgálható. Nem határozhatók meg azok az elemek, amelyek rezonancia vonalai a levegőben is megtalálhatók (pl.: C, halogének, S). ppm, ppb teljesítmény Alkalmazás: Környezetvédelem, élelmiszeripar, egészségügy. (pl. toxikus elemek (ólom,higany) kimutatása) Vérben lévő elemek koncentrációjának meghatározása jelentős diagnosztikai eszköz. (pl.: Na, K – elektrolitháztartás; Li, Cu, Al )

IV/2. Abszorpciós molekula spektroszkópia Alkalmazás Oldatok koncentrációjának mérése. Pl. fehérjeoldatok Időbeli változások detektálása. Elektroforézis nyomon követése. Leggyakrabban UV és a látható tartományban alkalmazzák. Kromofór (fényt elnyelő) molekulák az emberi szervezetben Endogén kromofórok pl. nukleinsavak, fehérjék Exogén kromofórok pl. ételfestékek, gyógyszerek

IV/2. Abszorpciós molekula spektroszkópia Fehérjék abszorpciója Fehérjeépítő aminosavak - fenilalanin, triptofán, tirozin - abszorpciós spektruma vizes oldatban

IV/3. Fotodinamikus hatás Fotodinamikus terápia (PDT), fotodinamikus diagnosztika (PDD) onkológia ígéretes ágazata alapja: a fotoszenzibilátor anyagok a tumorban nagyobb mennyiségben halmozódik fel, mint a normál szövetben megfelelő hullámhosszú fénnyel gerjesztik a festékanyagot (látható vörös tartományban, mivel itt nagy a szervezet fényáteresztő képessége) a gerjesztett festék energiája felhasználásával szingulett állapotú oxigént állít elő (nagyon aktív) oxidáció következményeként roncsolódik a sejt PDD: gerjesztés után fluoreszkál a festék, „láthatóvá” teszi a tumorszövetet

V. Lumineszcencia Def.: Egyes anyagok spontán fénykibocsátása elektrongerjesztést követően. Fajtái: (elektrongerjesztés módja) Fotolumineszcencia (foton elnyelése) Kemo-,biolumineszcencia (kémiai reakció) Elektrolumineszcencia (elektromos tér) Termolumineszcencia (hőközlés) Tribolumineszcencia (mechanikai energia, pl. deformáció)

V. Lumineszcencia Jellemző tulajdonságok Abszorpciós spektrum Emissziós spektrum Emisszió kvantumhatásfoka Gerjesztett állapot élettartama N: gerjesztett molekulák száma  : gerjesztett állapot élettartama Az emisszió polarizáció foka I V : vertikális polarizáció I H : horizontális polarizáció

V/1. Fluorimetria Fluoreszcencia jelenségén alapuló spektroszkópiai módszer. Atomok, molekulák egy része gerjesztés hatására fluoreszkál, vagy más módszerek segítségével (pl. kémiai reakció) fluoreszcenciára vehető. A kibocsátott fény hullámhossza eltér a gerjesztő fénytől, ami pontos mérést tesz lehetővé. Fluoriméter felépítése: - fényforrás: gerjeszti a fluoreszkáló mintát – ívlámpa, gázkisülési cső, lézer - a minta által emittált fény felbontását végző monokromátor - detektor

V/1. Fluorimetria Eljárás: a mérendő vegyületet extrahálni kell a vizsgált anyagból alkalmas oldószerrel kell feloldani (az oldószer ne legyen érzékeny a mérésben használt hullámhosszakra) kalibrációs görbe előzetes felvétele csak híg oldatok esetén van egyenes arányosság a fluoreszcencia intenzitása és a fluoreszkáló anyag koncentrációja között

V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Atomfluoreszcencia: Kis mennyiségek esetén pontosabb lehet, mint az atomabszorpciós fotometriai módszer. Molekulák, vegyületek meghatározása: Orvosi, diagnosztikai felhasználás: Porfirinek - vérből, vizeletből székletből Katekolaminok – vizeletből Kortizol – vérből Ösztrogén hormonok - vizeletből

V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Immunofluoreszcencia Szervezetbe kerülő testidegen anyagok immunreakciót váltanak ki, a szervezet antitesteket termel. Ismeretlen mennyiségű antigént tartalmazó mintához ismert mennyiségű fluoreszcens antigént tartalmazót kevernek. A jelölt, jelöletlen antigének kötődnek az antitestekhez. A fluoreszcencia mértékéből lehet számítani a nem jelölt antigének arányát. A fehérjék jelzése pl. fluoreszcin-izotiocianáttal (FITC) történik. Gyors, nagy érzékenységű módszer. A módszer nem tökéletesen specifikus egy adott antigénre.

V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Véredények vizsgálata fluoreszcencia segítségével Maga a vér és a véredények nem fluoreszkának. Savas fluoreszcenciás festéket juttatnak a véráramba. A festék a véredényekben szétterjedve láthatóvá teszi azokat. pl. - angiográfiában alkalmazzák koszorúerek vizsgálatára - onkológiában tumorok felismerésére, méretének becslésére

V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Fluoreszcencia aktivált sejtanalízis és sejtszeparálás Heterogén sejtpopulációk sejtenkénti analízise. A különböző sejteket tartalmazó szuszpenziót olyan kicsi cseppekre porlasztják, amik maximum egy sejtet tartalmaznak. A cseppek a szétbontás közben elektromos töltést is kapnak. A cseppeket egyesével gerjesztik (lézerrel). A sejteket tartalmazó cseppeket osztályozni lehet a sejt fluoreszcenciájának detektálásával. Végül elektromos térben minden cseppet a neki megfelelő edény irányába térítenek el.

V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Fluoreszcencia aktivált sejtanalízis és sejtszeparálás (folyt.) Eredmények, alkalmazás: Nagyon gyors módszer (10e sejt/sec) Rákos sejtek analízise, szétválasztása Gyógyszerek hatásának vizsgálata Kromoszóma vizsgálat Sejten belüli enzim aktivitás Lektinkötőképesség DNS-RNS tartalom mérése

V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Fehérjék, aminosavak vizsgálata A fenilalanin, tirozin, triptofán UV hatására fluoreszkál. A fluoreszcencia jellemzőit az aminosavak környezete befolyásolja. => Fehérjedinamikára, a fluoreszkáló aminosav térbeli hozzáférhetőségére lehet következtetni. Nukleinsavak vizsgálata Nem, vagy gyengén fluoreszkál. Festék hozzáadása szükséges.

V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek FRAP (fluorescent recovery after photobleaching) A sejt membránján mozgó (a membrán síkján) molekulák nyomon követése. A vizsgálni kívánt membránkomponenseket megjelölik fluoreszkáló festékkel, megzavarják egyenletes eloszlásukat. Kis területen lézerrel megvilágítva elroncsolják a felületen lévő festékmolekulákat. A többi festett molekula diffúzióját a fakított területen meg tudják figyelni fluoreszcencia intenzitásának időbeli változásából. pl. fehérjék diffúziójának mérése