A PNH KIMUTATÁSA ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL: A LEGÚJABB FESTÉSI ELJÁRÁSOK Barna Gábor, Márk Ágnes, Csomor Judit, Matolcsy András I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Semmelweis Egyetem
A PNH észlelhető tünetei Érzékelhető tünetek Kimerültség: Fáradtság Napi feladatok ellátása nehézségekbe ütközik Gyengeség Fájdalom Gyomor fájás Lábfájás vagy dagadás Mellkasi fájdalom Hátfájás Más tünetek: Sötét vizelet Légzés elégtelenség Nyelési nehézség Sárgaság Erekció zavar A paroxismális nocturnális hemoglobinurea (PNH), egy ritka őssejt eredetű megbetegedés. Vérrögök Vesebetegség Szervkárosodás Stroke szívinfarktus Jelek, amelyeket nem mindig érzünk
A PNH klinikai tünetei Intravasculáris hemolízis (hemoglobin urea), emelkedett plazma hemoglobin szint Megmagyarázhatatlan hemolízis: vas-hiány vagy, hasi fájdalom vagy nyelőcső görcs vagy thrombózis, vagy granulocytopénia és/vagy trombocitopénia Coombs negatív, nem-schistocytás, nem fertőzés eredetű hemolítikus anémia Thrombózis szokatlan tulajdonságokkal: Szokatlan helyen: hepatikus vénákban (Budd-Chiari syndroma) más hasivénákban cerebral szinuszokban bőrvénákban Megmagyarázhatatlan cytopénia Csontvelő elégtelenség: várható vagy bizonyított aplastikus vagy hypoplasztikus anémia refrakter cytopénia egyvonalas diszpláziával ismeretlen eredetű cytopénia
A PNH molekuláris háttere A PNH egy ritka, klonális hematopoietikus őssejt (HSC) eredetű megbetegedés. A HSC-ben mutálódik az X-kromoszómán levő PIG-A gén. PIG-A: phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class A Ez a gén játszik szerepet a glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) anchor (horgony) szintézisében. A mutációs státusz szerinti osztályozás Type I: normál sejtek Type II: missense mutáció – részleges szintézis hiba Type III: nonsense mutáció – a bioszintézis teljes hiánya
A GPI horgony szerkezete Pu JJ, Brodsky RA. Clin Transl Sci. 2011
A GPI-horgonnyal rendelkező fehérjék bioszintézise Phosphatidyl inositol Pu JJ, Brodsky RA. Clin Transl Sci N-acetylglucosamine transzfer Mannóz egységek Fehérje rész GPI szignál peptiddel
A PIG-A mutáció eredete Pu JJ, Brodsky RA. Clin Transl Sci. 2011
Richards SJ, Cytometry GPI horgonnyal rendelkező fehérjék
A komplement rendszer és a hemolízis Pu JJ, Brodsky RA. Clin Transl Sci ép erythrocyta
A nitrogén monoxid (NO) metabolizmusa Pu JJ, Brodsky RA. Clin Transl Sci A hemolízis szabad hemoglobint generál, ami NO-t köt. Az erythrocyta argináz kiszabadul a vvt-kből és csökkenti az arginin szintjét (NO képződés szubsztrátja). Csökkent az NO szint fáradság, fájdalom, thrombózis, stb.
PNH kimutatása VVT-ken CD59 Normál Type I. sejtek PNH-s sejtek Type III. és II. Eculizumab kezelés előtt után MJ Borowitz Clinical Cytometry 2010
granulocytákon monocytákon Egy paraméter vizsgálata a különböző sejtpopulációkon Normál sejtek PNH-s sejtek A granulocyták között megjelenő PNH-s klón nagysága mutatja igazán a PNH-s klón mennyiségét
FLAER hatásmechanizmusa és használhatósága FLAER: Fluorescein-labeled Aerolysin Az Aeromonas hydrophila baktérium termelte protoxin, proaerolysin, szelektíven kötődik a GPI horgonyhoz. Mivel a GPI horgonyhoz kötődik, ezért minden sejtvonalnál lehet használni. VVT-knél a glycophorin kis mértékben köti a FLAER-t, így gátolja GPI fehérjék ill. hiányuknak a kimutatását, ezért vvt-n nem ajánlott a használata.
PNH-s monocyta monocyták normál monocyta granulocyták normál granulocyta PNH-s granulocyta Összetapadt sejtek kizárása Két paraméter vizsgálata a különböző sejtpopulációkon A fals negatív sejtek kizárása!!
PNH klón kimutatása lymphocytából? A lymphocyták között megjelenő FLAER negatív populáció nem megbíz- ható a PNH-s populáció mennyiségének megítélésére.
Kisméretű PNH klón kimutatása A módszer alkalmas kisméretű PNH klón populáció kimutatására is megfelelő mennyiségű sejt/esemény mérésével. PNH-s klón 0,1 % az összes sejt között Kis méretű PNH fenotípusú klón (0,1-20 % kóros granulocyta) megjelenhet az aplasztikus anémiás esetek 60 %-ában, valamint MDS-ben is (0,01-2 % kóros granulocyta).
PNH-s vizsgálatok alakulása
Összefoglalás A technika fejlődésével egyre javul a ritka betegségek kimutathatósága. Az áramlás citometria pedig egy megfelelő módszer erre! Viszont a kapott adatokat körültekintően kell értékelni!
Köszönöm a figyelmet!