Molekuláris klónozás a gyakorlatban

CRISPR/Cas rendszerek Adaptív bakteriális immunitás Idegen nukleinsavak ellen ( pl. vírusok) Ezek integrálása a genomba, rövid, ismétlődő szekvenciák közé RNS alapú felismerés ( guide RNS), RNS mediált DNS hasítás, degradáció a Cas endonukleázokkal -> Számos géntechnológiai applikáció :specifikus géncsendesítés, represszió, aktiváció

A plazmid alapú molekuláris klónozás alapsémája

Kazettacserés klónozás 2-es plazmid ampicillin rezisztenciájú, valamiért nem működő plazmid 1-es plazmid az előzővel megegyező, klóramfenikol rezisztenciájú, jól működő Kazettacsere: 1-es plazmid backbone-t megtartjuk, 2-es plazmidból rezisztenciagén átemelése Az így kapott 3-as plazmid a 1-es vektorral megegyező, de már ampicillin rezisztenciájú plazmid lesz Vajon működik?

2-es plazmid Ampicillin rezisztencia

1-es plazmid Klóramfenikol rezisztencia

3-as plazmid 1-es plazmid backbone 2-es plazmid rezisztencia

I.Plazmidok emésztése SacI-val és Eco88I-vel mindkét plazmid -> egyforma túlnyúló végek Double digest

Ideális

Emésztett vektorok 3-as plazmid 1-es plazmid:2-es plazmid:

Emészési elegy: -> 2 óra inkubálás 37 °C-on 1-es plazmid2-es plazmid DNS34 µl (ami 2µg-nak felel meg)15,49 µl (ami 2µg-nak felel meg) SacI1 µl Eco88I1 µl Tango puffer4 µl2 µl Mq-0,51 µl ∑40 µl∑20 µl

II. Gélből izolálás 0,6 %-os agaróz gél a DNS izolálásához 6x-os LD (Loading Dye) pre-mixed puffer 20 perc futtatás után:  1-es plazmidból 5523-as csík  2-es plazmidból 1216-os csík

III.Nucleospin DNS izolálása gélből 2x-es NTI a mintához képest Oszlopra pipettázás, fugálás NT3-al mosás 70 °C-os vízzel eluálás az oszlopról Koncentráció mérés Nanodroppal

DNS linker ligálása vektorba Rezisztenciagén Origó

A klónozás célja A Cas9 fehérjéhez guide RNS kicserélése -> más DNS szakaszt hasít EcoRI hasítóhely eltüntetése: ha ezzel hasítjuk, a kiindulási vektorokat megvágja, a terméket nem olcsó EcoRI ár Kiindulási vektor Termék, EcoRI hasítóhely nélkül

Vektor emésztése BpiI restrikciós endonukleáz Type II S : a felismerő hely nem azonos a hasítás helyével A hasítás során kivágódik a felismerő hely Ha az inszert beépül :az enzim nem tud vágni Ha az inszert nem épül be : újra megvágja

A BpiI enzim hasító- és felismerőhelye FelismerőhelyHasítóhely

Megfelelő puffer kiválasztása Minden enzim egy adott pH-n és közegben működik a leghatékonyabban Különböző előre összeállított pufferek állnak rendelkezésre ( Thermo Scientific cég) BpiI : G pufferben a leghatékonyabb

DNS linker ligálása vektorba Linker : - Szintetikus hibridizált komplementer oligonukleotidok - Hibridizálás PCR készülékben : 95˚C-ra felmelegítés, lassú hűtés(1,5 óra ) 4 ˚C-ra Túlnyúló végek : a klónozáshoz tervezve, egy orientációban épülhet be DNS linker EcoRI hasítóhely nélkül

Ligálás Kiindulási vektorDNS linker Termék

Ligálás Ligálási elegy: insert, vektor, ligáz, ATP, puffer, mq 30 perc inkubálás szobahőmérsékleten Ligáz inaktiválás 70 °C-on 5 percig Visszavágás: egy olyan enzimmel emésztjük meg a ligálási elegyet, ami a kiindulási plazmidban megtalálható, a kész termékben nem 50 ng vektor+ x insert insert ng=(3x vektor ng x insert bp)/vektor bp

Transzformálás baktériumba Kompetens sejtek készítése / vásárlása Plazmid bejuttatása :Hősokk ( 42˚C-on 1 percig) Antibiotikum-mentes LB médiumba rázatás Szelekciós táptalajra szélesztés (gyöngyökkel) Overnight inkubálás A kívánt telepek leoltása

Miniprep készítése tesztemésztéshez Miniprep : Alkalikus lízisen alapuló DNS izolálás / tisztítás µg DNS izolálására alkalmas Előtte minden telepből glicerines baktériumminta elrakása -80 ˚C-ra Többféle puffer segítségével nyerhető ki a DNS: P1: RN-áz tartalmú izotóniás oldat P2: sejtek lizálásához szükséges oldat P3: Fehérjék, és a genomi DNS kicsapásához szükséges oldat Ezután a DNS alkoholos kicsapása következik(izopropanol), majd az alkohol szárítása Végül nukleáz-mentes vízbe rakjuk a kinyert DNS-t.

Tesztemésztés Leoltott telepekből a megfelelő klónok kiválasztása Enzim kiválasztása : A kiindulási plazmid, és a klónok szekvenciájában vannak különségek Ugyanazzal az enzimmel való hasítás : más fragmentumok keletleznek Kiindulási vektor Jó klón

Tesztemésztés Kiindulási vektor Jó klón Kiválasztott enzimek : BsaI, EcoRI VAN EcoRI NINCS EcoRI

Tesztemésztés A kiválasztott enzimek : EcoRI, BsaI A klónnál : A kiindulási vektornál : Agaróz gél szimuláció : Látható a különbség Jó klón Kiindulási vektor Jó klón Kiindulási vektor

Szekvenálás Szekvenálásra küldés előtt nucleospin (tisztítás) Sanger féle szekvenálás Megfelelő szekvenáló primerek kiválasztása

VÉGE