Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 Allergiás asztma genomikai háttere 2007. november 14. Ungvári Ildikó – SE, GSII.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 Allergiás asztma genomikai háttere 2007. november 14. Ungvári Ildikó – SE, GSII."— Előadás másolata:

1 1 Allergiás asztma genomikai háttere november 14. Ungvári Ildikó – SE, GSII

2 2 Asztma (Asthma bronchiale) krónikus légúti betegség. Jellemző a kis légutak epizódokban jelentkező gyulladása és szűkülete különböző triggerelő tényezőkre. Az asztma rohamok lehetnek enyhék és életveszélyesen súlyosak. Tünetei:légszomj, köhögés, zihálás, mellkasi fájdalom, és feszülés, valamint ezek kombinációi. A kiváltó okok lehetnek: allergének, fertőzés (vírus/ baktérium), fizikai munka, hirtelen éghajlatváltozás, légszennyezések mint pl. cigarettafüst + hajlamosító genetikai háttér típusai:- allergiás asztma (extrinsic asztma) : immunológiai mechanizmusok által mediált, - nem-allergiás asztma (intrinsic asztma) Két fázis: korai tünetek: perccel, késői: 4-6 órával a provokáció (pl. antigén belélegzés) után.

3 3 Az allergiás megbetegedések új definíciói I. (EAACI javaslat 2001 szeptember) Az allergia immunológiai mechanizmus által indított túlérzékenységi reakció. Az allergián belül megkülönböztethetünk IgE által, és nem-IgE által mediált allergiát. Az atópia az egyéni, vagy családi hajlam arra, hogy az egyén alacsony dózisú allergén, általában fehérjék hatására IgE ellenanyagot termeljen és olyan jellegzetes tüneteket mutasson mint az asztma, rhinoconjunctivitis, vagy az ekcéma/dermatitis.

4 4 > 150 millió asztmás van a világon, a leggyakoribb krónikus betegség gyermekkorban. USA: 11 milliárd $/év

5 5 Asztma gyakorisága néhány országban egy as felmérés alapján 6-7 és évesek UK 20.9%24.7% Germany12.8%17.5% Austria 7.4%15.1% USA-22.3% Japan 18.2%13.0% New Zealand22.2%26.7% Indonesia2.8%5.2%

6 6 Az allergiás betegségek heterogenitása Az allergiás asztmás betegeknek 60-80%-nak szintén van allergiás rhinitise. Az allergiás rhinitises betegek %-ának van asztmája. Becslések szerint az AEDS-es (atópiás ekcéma/dermatitis szindróma) újszülöttek 40%-nál 3-4 éves korára asztma fog kialakulni. Más tanulmányokban az asztmás betegek 35%-nak van AEDS-e. Genomikai vizsgálatokban az asztmás csoportban általában ugyanúgy kezelik azokat a betegeket, akiknek asztmája és allergiás rhinitise van, mint az asztmás és AEDS-es betegeket. Feltéve, hogy vannak olyan gének, amelyek az alsó légutak gyulladásáért felelősek (asztma), vannak olyanok, amelyek a felsőért (rhinitis), vagy általában az atópiás hajlamért, vagy az ekcémáért, ezek a gének könnyen elveszhetnek ezekben a vizsgálatokban.

7 7 Néhány immunológiai alapfogalom Antigén:Az érett immunrendszer által felismert (sokszor fehérjeeredetű) struktúrák. Antitest: B sejtek termelik, pl.: IgG,IgA, IgM, IgE Néhány immunsejt: –Antigén bemutató (prezentáló) sejtek (APC): pl.: B sejt, monocita/makrofág, dendritikus sejtek: bekebeleznek (internalizálnak) különböző struktúrákat (pl: mikróbák, virágpor stb.), majd egy darabkájukat (az antigént) a felszínűkre viszik MHCII molekulákhoz kapcsoltan. B sejt makrofág

8 8 –T sejtek: felületükön levő receptorukkal (TCR) hozzákötődnek az antigén-MHCII komplexhez és néhány mellette levő molekulához (kostimulációs molekulák) és aktiválódnak, különböző anyagokat bocsájtanak ki a környezetükbe. Asztmában fontos: CD4+ T helper sejtek (Th). Th0 sejtek citokinek hatására differenciálódhatnak Th1, vagy Th2 irányba

9 9 Th2 sejt-B sejt kölcsönhatás

10 10 Th0 sejt Th2 Th1

11 11 Az asztma gyakoriságának emelkedése A XX. század elején Budapesten évente egy- két új asztmás gyereket diagnosztizáltak, 2002-ben t.

12 12 Miért emelkednek az allergiás betegségek prevalencái? Legelfogadottabb a tisztasághipotézis (Th1 trigger hipotézis) : a nyugati típusú társadalmakban nem engedjük, hogy a Th1 felé eltolódott immunválasz kialakuljon. Th1 érés (maturation) hipotézis: A Th1 érés defektussal született gyerekek régebben meghaltak, manapság a jobb egészségügyi ellátás miatt életben maradnak, de allergiások, asztmásak lesznek.

13 13 Miért emelkednek az allergiás betegségek prevalencái? (II) Antibiotikumok használata A levegőben levő szennyeződések reagálnak az allergénekkel és agresszívabbá teszik őket.

14 14 Az asztmára való hajlam fő oka, hogy a Th1/Th2 egyensúly eltolódik Th2 irányba

15 15 Elhunyt asztmás tinédzser tüdőszövettani vizsgálata. Fő jellemzők: I = gyulladás (gyulladási sejtek beáramlása), MP = mucus plugging: légutakat a nyák eldugaszolja, Légúti remodelling: SF= subepitéliális fibrózis: kollagén lerakódás, MH= miociták hipertrófiája és hiperpláziája: a simaizmok térfogatának és számának növekedése, N= neovascularisatio: új erek képződése; ezek irreverzibilis változások

16 16 Légúti hiperreaktivitás (AHR= airway hyperresponsiveness, BHR = bronchial...): az asztma egyik jellemzője. Túlérzékenység különböző stimulusokra, mint például: allergének, légszennyeződések, hideg levegő, fizikai munka, metakolin, hisztamin stb. A kiváltó ok megszüntetésével, vagy glükokortikoid hatására a fulladás megszűnik. Légúti hiperreaktivitás mértéke különböző súlyosságú asztmás betegekben (metakolin (Mch) hatására spirométerrel) FEV1: forced expiratory volume 1s

17 17 Egér asztma modell előnyei Humán asztmához hasonló jellemzők –Ag-spec IgE –Hízósejtek, T-limfociták, eozinofilek infiltrációja a tüdőbe –Th 2 citokin mintázat –Légúti túlérzékenység nem-specifikus bronchokonstriktorokra (MCh) Szövetek hisztopatológiai vizsgálatának lehetősége Genetikailag módosított egerek: KO, TG Egér specifikus ellenanyagok és reagensek Terápiás eszközök kipróbálásának lehetősége

18 18 Egér asztma modell hátrányai Nem krónikus Eozinofilek nem degranulálódnak Az egerek nem köhögnek A különböző egértörzsek máshogy reagálnak

19 19 Egér asztma modell I.p. OVA (hasba) I.p. OVAOVA inhaláció + Al(OH) 3 + Al(OH) 3 1 % 5 % Légúti túlérzékenység mérése Tüdő-szövettani vizsgálat BAL (bronchoalveoláris lavage ) sejtösszetétel vizsgálata BAL FACS analízis Szérum IgE mérés Génexpressziós vizsgálatok Szenzitizálás I Provokáció Szenzitizálás II

20 20 Az allergiás folyamat főbb szereplői endothel-VCAM-1

21 21 T sejtek (limfociták) szerepe Az egész asztmatikus folyamat legfontosabb szereplői T sejt hiányos egéren nem lehet asztmát előidézni Th1 citokinek : INF , IL-12, IL-18, TNF  Th2 citokinek: IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-9, IL-10. Th2/Th1 egyensúly eltolódása: az asztma Th2-es betegség Nélkülözhetetlenek: CD4+ T sejtek, MHCII, CD28 SCID: severe combined immunodeficiency: nincs T sejtje, és B sejtje: genetikai manipulációval állítják elő: allergén, vagy más provokáció hatására nem lesz asztmás

22 22 SCID egértüdő +OVA kezelés SCID egértüdő + OVA + Th2 sejtek SCID egértüdő + OVA + Th1 sejtek SCID egértüdő+OVA+Th1+Th2

23 23 Légúti hiperreaktivitás SCID egerekben intravénás Th0, Th1 és Th2 és intranazális OVA adása után. AHR csak a Th0 és Th2 sejtek injektálása után figyelhető meg.

24 24 Eozinofilek szerepe Szintje szinkronban van az asztma súlyosságával granulumok: hisztamin, különböző enzimek (RNáz, DNáz), MBP (major basic protein) : fő mm. károsító fehérje-emberben! Egérben MBP nélkül is AHR - hisztamin felszabadítás hízósejtekből, bazofilekből - alveoláris makrofágok aktiválása - epitéliális sejtkárosítás

25 25 Effektor hatásán túl immunválasz moduláló hatása is van: termelhet mind Th1, mind Th2 citokineket, befolyásolja APC-ként is a Th2 sejtek működését. CCR3 kemokin receptort tartalmaz Fő kemoattraktánsai: eotaxinok, RANTES, MCP-k

26 26 Hízósejtek (masztociták) szerepe Azonali allergiás reakció Hízósejt hiányos egér (allergén kezelés után): korai AHR nincs, késői AHR viszont van IL-4, IL-5, IL-9 TNFa + leukotriének, prosztaglandinok Th2 Hízósejt degranuláció Késői allergiás reakció

27 27 A hisztamin szerepe allergiában és asztmában Hízósejtek és a bazofilek termelik. A hisztamin a korai asztmatikus reakció tünet- együttesének fontos mediátora. –Simaizom kontrakció –Érpermeabilitás –Vazodilatáció –Mucus szekréció A plazma hisztamin koncentrációja korrelál az asztma súlyosságával. H1 receptor antagonisták szerepe Hisztidin dekarboxiláz: hisztamint szintetizál; HDC KO egér: nincs endogén hisztaminja

28 28 Légzésfunkciós vizsgálatok: hisztamin hiányos (HDC KO) egereken OVA kezelés hatására szignifikánsan kisebb AHR alakul ki HDC KO kezelt WT kezelt

29 29 Tüdő-szövettani vizsgálatok A HDC KO egerek tüdeje OVA kezelés hatására alig különbözik a placebóval kezelt állatokétól WT allergizált KO allergizált placebo

30 30B-limfociták Th2 IgE

31 31 Ag-specifikus IgE, szenzitizált egereken AHR-t vált ki: FceRI KO egereken nem, CD23 KO-n igen T sejt KO egereken Ag-spec IgE nem okoz eozinofiliát és AHR-t. Ezeket IL-5-tel lehet visszaállítani. B sejt hiányos egereken légúti Ag szenzitizálás T sejt aktiválást és Th2 citokin termelést és eozinofiliát okozott, de nem volt AHR. Szisztémás Ag szenzitizálásnál volt AHR is: IgE nem létfontosságú az asztmában Fontos szerep a hízósejtek aktiválásában, és az azonnali allergiás reakciókban. Két receptor: nagy affinitású: FceRI; kis affinitású: CD23(FceRII) IgE szerepe

32 32 WT (A,B) és IgE hiányos (C,D) állatok tüdeje „asztmásítás” után nem különbözik egymástól: IgE-nek nincs létfontosságú szerepe az asztma kialakulásában egerekben.Eozinofilek és limfociták infiltrációja figyelhető meg perivasculárisan és peribronchiálisan. Br, bronchiole; PlaceboAllergénnel kezelt, asztmatikus WT IgE KO

33 33 Gyulladásos sejtek infiltrációja a tüdőben WT és IgE hiányos egereken: allergén kezelés (Af) után nincs szignifikáns különbség IgE KO egér

34 34 IL-4 szerepe endothel-VCAM-1 Th0 sejtek differenciálása Th2 sejtekké B sejt átkapcsolása IgE termelésre Endothel sejtek VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule) termelését (mRNS) erősíti (ez szükséges az eozinofilek szövetbe történő infiltrációjához) Epithel sejtek eotaxin termelését fokozza: eozinofilek odavonzása Hízósejt érés kofaktora

35 35 IL-4 KO egér (C57BL/6 törzs) OVA kezelés után nincs IgE, légúti eozinofilia, AHR OVA spec. IgE adagolás: nincs légúti eozinofilia, AHR IL-5 adagolás: légúti eozinofilia, AHR kialakul Az IL-4 legfontosabb szerepe: szenzitizáláskor Th2 irányba tolja el az immunválaszt, elősegítve így az IL-5 termelést. Egértörzsenként különböző eredmények: BALB/c IL-4 KO egerekben kialakulnak az asztmatikus tünetek (AHR) OVA hatására: más a patomechanizmus ebben az egértörzsben –IL-13, IL-4R, STAT6 szerepe

36 36 IL-5 szerepe Eozinofilek érését, csontvelőből való kiáramlását serkenti, növeli életképességét, érzékenyíti kemotaktikus mediátorokra, erősíti a citotoxicitását és az endothélhez való adhézióját. endothel-VCAM-1 IL-5 transzgenikus egérben (a tüdő epitél sejtekben, Clara cell 10 gén (CC10) promótere után) magas az eozinofilszám és súlyos asztma alakul ki.

37 37 IL-5 túlexpressziója a tüdő epitél sejtjeiben. a: WT egér, b,c,d: IL- 5 transzgenikus egér; b,c, d: a légutak csaknem blokkolva vannak a megduzzadt peribronchiális szövetektől B, bronchiole; PV, pulmonary blood vessel; AS, alveolar space; BALT, bronchus-associated lymphoid tissue.

38 38 Sejtszámok a tüdőben Üres négyzet: vad, fekete négyzet: IL-5 Tg egér.

39 39 IL-5 szerepe Eozinofilek érését, csontvelőből való kiáramlását serkenti, növeli életképességét, érzékenyíti kemotaktikus mediátorokra, erősíti a citotoxicitását és az endothélhez való adhézióját. Anti-IL-5 Ag provokálás (Ag belélegeztetés) előtt megakadályozta az eozinofíliát és az AHR-t IL-5 KO állat: normális IgE és T sejt válasz, de nincs eozinofilia és AHR

40 40 IL-5 és IL-4 KO egereknél nincsen fokozott AHR (C57BL/6)

41 41 IL-5-tel (AV5) igen, IgE-vel nem lehet visszaállítani a fokozott AHR-t IL-4 KO egerekben (IL-4 (AV4) adásával is kialakul az AHR)

42 42 IL-13 szerepe Közös receptor alegység az IL-4-gyel (IL-4Ra) Mucus termelést, AHR-t és eotaxin termelést erősíti, transzgenikusan: AHR-t okoz endothel-VCAM-1

43 43 WT (wild type) és IL-13 transzgén egér légútjai Ag provokáció nélkül vs provokáció után

44 44 IL-13 szerepe Közös receptor alegység az IL-4-gyel (IL-4R  ) Mucus termelést, AHR-t és eotaxin termelést erősíti, adagolása AHR-t okoz IL-13 függő pathomechanizmus Elnyomja az IL-5 expressziót IL-13 KO egér (allergén szenzitizálás és provokálás után): csökkent eozinofilia, mucus, légúti gyulladás, AHR IL-13 neutralizálása hatásosabb, mint az IL-4-é

45 45 Mucus termelő sejtek száma a bronchusok epitéliumában WT és IL-13 KO állatokban

46 46 IL-9 szerepe T sejtek növekedési faktora, B sejtek érését és a hízósejtek proliferációját elősegíti. endothel-VCAM-1

47 47 IL-9 TG-egér (IL-9 a CC10 promóter után: IL-9 túlexpressziója a tüdő epitéliumában) : tüdő eozinofil szám bronchus epitélsejtjei nagyobbak (hipertrófia) mucus képződés, hízósejtek az epitéliumban (kontrollokéban nem) De alacsony hisztamin: hízósejtek nem degranulálódtak!!! kontrollTG

48 48 IL-9 KO egér: nem különbözött a kontrolltól: Ugyanúgy kialakult OVA kezelés hatására az AHR, légúti eozinofília stb. Az IL-9 szerepét átvették más citokinek. Pl.: IL-13: mucus termelés, IL-4, IL-5: eozinofil toborzása, hízósejt érés stb.

49 49 Asztma kialakulásának három lehetséges útja Hisztamin leukotriének

50 50 Kemokinek

51 51 Kemokinek szerepe Eotaxinok –Receptoruk: CCR3; Vonzzák: eozinofileket, Th2-t –Eozinofilek degranulációja –Eotaxin -/-: OVA szenzitizálás és provokáció után: hasonló AHR és eozinofilia mint a WT-ban: más kemokinek átveszik szerepét. MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) –Receptora: CCR2; Vonzza: monocitákat, (aktivált eozinofil), Bazofil degranuláció, Th2 polarizáció RANTES –Receptor: CCR1,3,5; Vonzza: eozinofileket –Bazofil degranuláció, IgE termelés fokozása MIP-1 , MCP-3,4, MDC, IP-10 stb.

52 52 eozinofilek, hízósejtek, bazofilek, Th2 sejtek felszínén kemokin receptor: eotaxinok, RANTES, MCP-2,3,4, MIP- 1a receptora Fontos szerep az eozinofilek kemotaxisában és a Th2 sejtek toborzásában OVA kezelt CCR3 KO: csökkent légúti eozinofília, de AHR volt CC kemokin receptor 3 (CCR3) és az asztma

53 53 Eozinofilszám a tüdőben vad (üres hasáb) és CCR3 KO egér tüdejében és BAL-jában placebo (sham) és OVA kezelés után

54 54 KO állatban az eozinofilek a vérerekben maradtak az endothel sejtek alatt, míg a WT állatban beáramoltak a tüdőszövetbe a T sejtekkel együtt. De 4-12x annyi hízósejt, és emelkedett AHR a CCR3 KO állatban vs WT: -/-+/+

55 55 Transzkripciós faktorok szerepe: T-bet a Th1-es, GATA-3 a Th2-es immunválasz fő transzkripciós faktora

56 56 Humán eredmény: Asztmások tüdejében alacsonyabb a T-bet expresszió, mint nem- asztmásokban. Előállítottak T-bet hiányos egereket. Az egereken spontán, a humán krónikus asztmához hasonló állapot alakult ki.

57 57 Már a T-bet szint 50%-os csökkenése is spontán (allergén-indukció nélküli) AHR-t vált ki: a Th1/Th2 egyensúly eltolódása Th2 irányba asztmát válthat ki.

58 58 Eozinofilek és limfociták perivaszkuláris és peribronchiális infiltrációja, kollagén lerakódás a légutak körül, simaizomsejtek hiperpláziája (remodelling) a T-bet -/- egerekben

59 59 GATA-3 génexpresszió szintje egészséges és asztmás emberek tüdejében

60 60 GATA-3 szerepe asztmában Szintje emelkedik az asztmások tüdejében GATA-3 KO: letális magzati korban, indukált deléció T sejtekben: OVA szenzitizálás és provokáció után: nincs légúti eozinofilia, AHR, és IgE válasz

61 61 Antisense GATA-3 (AS-GATA3) kezelés megszünteti egéren az OVA indukálta asztmatikus tüneteket A nonsense DNS (NS) kezelésnek nincs hatása: gyulladásos sejtek a tüdőben AS-GATA3 kezelés: megszünteti a mucus termelést és a gyulladást OVA kezelés hatására a légutak mucussal eltömődnek, és gyulladások sejtek infiltrálódnak a tüdőbe

62 62 GENOMIKA

63 63 Multifaktoriális betegség Például: allergiás betegségek, asztma, rák, magas vérnyomás, cukorbetegség, kardiovaszkuláris betegségek. Gyakoriak (vs. monogénes betegségek). Pl.: asztma gyakorisága 6-10%, kardiovaszkuláris halál az összes halál ok 39%-a. Családi halmozódás, de nem mendeli öröklődés. Általában gyakoribbak a poszt-reprodukciós korban: nincs kiszelektálódás A gyakori multifaktoriális betegségek kezelése óriási pénzeket emészt fel. Pl.: kardiovaszkuláris betegségek: USA >100 milliárd $/év, asztma 11 milliárd $/év.

64 64 Az öröklődés vizsgálata Eredmények Szegregációs analízis Egyik szülő sem atópiás: a gyermekek 11-13%-a; mindkét szülő: a gyermekek 50-70% igen Magyarország: Az asztmások gyerekeinek 26,7% atópiás (leggyakrabban asztmás) Ikervizsgálatok: –Egypetéjű ikreknél az asztma konkordanciája: 26-75% Testvérvizsgálatok: –Asztma λs=2,0, bár egyes populációkban magasabb : λs>7 (atópiás allergia:2 alatt szubfenotipus!)

65 65 Családi halmozódás összehasonlítása a populációs gyakorisággal: R érték: a betegség esélye az R rokonban osztva a betegség esélyével (gyakoriságával) a teljes populációban. Leggyakrabban használt : s; s= sib (ált. monozigóta) Minél nagyobb a R érték 1-nél, annál nagyobb a genetikai hányad a jellemzőben (betegségben). R =1 azt jelenti, hogy a jellemzőnek nincs öröklődő hányada.

66 66 Az öröklődés vizsgálata Eredmények Szegregációs analízis Egyik szülő sem atópiás: a gyermekek 11-13%-a; mindkét szülő: a gyermekek 50-70% igen Magyarország: Az asztmások gyerekeinek 26,7% atópiás (leggyakrabban asztmás) Ikervizsgálatok: –Egypetéjű ikreknél az asztma konkordanciája: % Testvérvizsgálatok: –Asztma λs=2,0, bár egyes populációkban magasabb: λs>7 (atópiás allergia:2 alatt szubfenotipus!) Founder populációk (finn, észt, Amish, Hutterite)

67 67 Az atópiára való hajlam kockázata azokban a gyermekekben sokszor nagyobb, akiknek az anyja atópiás. Magyarázatok: – anya-magzat immunológia egymásra hatása a terhesség alatt, illetve a szoptatáskor – genetikai imprinting, azaz azok közül a gének közül, amelyek az atópiára hajlamosítanak inkább az anyaiak fejeződnek ki.

68 68 Multifaktoriális betegségek genomikai hátterének tisztázását nehezítő jellemzők Fenokópia: Kizárólag környezeti hatások ugyanazt a klinikai képet eredményezik, mint a genetikai tényezők Pleiotrópia: Ugyanaz a mutáció a környezet hatására más klinikai képet eredményezhet. Nehéz a pontos diagnózis: –Életkorral változhat a klinikai kép –A tünetek epizódokban jelentkezhetnek –Más betegség hasonló tünetekkel –A különböző betegségek gyakran együtt fordulnak elő. endofenotípusok!!

69 69 Óriási erőfeszítések, kevés siker. Miért? Rengeteg gén + rengeteg, egész életen át tartó környezeti faktor egymásra hatásának populációs eloszlása adja a betegség populációs eloszlását. Egy egyén genotípusának teljes ismeretéből sem lehet megmondani teljes bizonyossággal a betegsége kezdetét, lefolyását, vagy a súlyosságát. Valószínűséget/kockázatot lehet mondani. Egy adott időpontban a fenotípust meghatározza az adott környezet és a genotípus egymásra hatása, amit befolyásol a korábbi környezetek és a genotípus interakciójából származó fenotípus. Egyes génvariációk hatása nagyon kicsi populációs szinten: nagy mintaszám szükséges, növekszik a heterogenitás, csökken a kockázati faktor. A betegséget okozó mutáció sokszor nem fehérjekódoló génben van, hanem szabályozó régióban. Ezt sokkal nehezebb megtalálni, hiszen jelenleg csak kevés szabályozó régiót ismerünk (ld. Junk DNS)

70 70 QTL vizsgálat egerekben QT-QTL A beltenyésztett egértörzsek közötti mérhető fenotípusos jellegekben különbségek vannak. Keresztezésekkel és visszakeresztezésekkel ezek nyomonkövetése, majd a különbséget okozó genetikai háttér tisztázása. Egér vizsgálatok

71 71 Kongenikus törzs létrehozása: olyan (pl. egér)törzs amely a fenotípusra „nem hajlamos” törzstől csak a hajlamosító régióban különbözik. Mindig a QT-t hordozót kell visszakeresztezni a QT-t nemhordozó szülői egértörzzsel. QTL vizsgálat egerekben

72 72

73 73 Kongenikus törzs létrehozása: olyan (pl. egér)törzs amely a fenotípusra „nem hajlamos” törzstől csak a hajlamosító régióban különbözik. Mindig a QT-t hordozót kell visszakeresztezni a QT-t nemhordozó szülői egértörzzsel. A QTL-t genomszűréssel meghatározni, további markerek segítségével finomítani. Elérhető felbontás kb. 1 cM. Pozicionális jelölt gének keresése. Humán ortológ keresése. Asszociációs vizsgálatok. QTL vizsgálat egerekben

74 74 3 asztmára jellemző fenotípus (AHR, eozinofil szám, IgE szint) összehasonlítása különböző egértörzseken melyeket ovalbuminnal illetve semleges pufferrel (kontroll állatok) kezeltek. PBS-sel, vagy OVA-val kezelt egerek Különböző egértörzsek AHR IgE szint BAL eozinofil szám A/JC3H/Hej Susan L. Ewart, Quantitative Trait Loci Controlling Allergen-Induced Airway Hyperresponsiveness in Inbred Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol. 23, pp. 537–545, 2000.

75 75 A/J egerek: legmarkánsabb asztmatikus tünetek; C3H/HeJ: legrezisztensebb az asztmával szemben ENNEK MI AZ OKA? QT: AHR QTL tanulmányozása az F2= A/J x (C3H/HeJ x A/J)F1 backcross egereken

76 76 AHR összehasonlítása 3 egérpopulációban; F1 = A/J x C3H/HeJ

77 77 AHR eloszlása különböző egértörzsekben 164 mikroszatellita marker, 10 cM felbontás.

78 78 LOD score csúcsok a 2-es kromoszómán QT: allergén indukálta AHR 2 különálló LOD csúcsot detektáltak (szaggatott vonal ) LOD = logarithm of odds, annak az esélynek a 10-es alapú logaritmusa, hogy két lókusz genetikailag kapcsolt, összehasonlítva annak az esélyével, hogy nem kapcsolt. Pl. LOD = 3 azt jelenti, hogy 1000x-es (10 3 x) a valószínűsége annak, hogy két lókusz együtt öröklődik, mint annak, hogy nem (0 hipotézis). (A LOD score =3 felel meg a p=0,05-ös valószínűségnek.)

79 79 Humán homológok: 1: D2Mit359–D2Mit416 neve: Abhr1, LOD: 4,2; humán homológok: 10p11-13, 2q12-q14,9q22-q34: GATA-3, IL-1R antagonista 2: D2Mit238–D2Mit298 neve: Abhr2 LOD: 3.7, humán homológok: 9q33-q34, 2q14-q24: prostaglandin synthase 1 3: D7Mit21–D7Mit56, LOD: 1,9, humán homológ: 19q13: IL-11

80 80 -GATA-3, IL-1R antagonista -ProstaglandinE2: asztmások tüdejében emelkedett a szintje, simaizom proliferációt (remodelling) és eozinofilek túlélését fokozza. PGD2: hízósejt termeli, lipid mediátor, macrophage- derived chemokine (MDC)-t indukálja, ami kemoattraktánsa a Th2 sejteknek. -IL-11: B sejtek Ig termelését stimulálja, túlexpressziója megnövekedett légúti ellenállást okoz Jelölt gének

81 81 Oligonukleotid-microarray High responderek low-responderek A/JC3H/HEJ BC1-high BC1-low 21 gén eltérő expresszióval: C5 gén, ami az Abhr2 közelében van alacsony expresszió magas SNP genotipizálás Homozigóták(D/D) 2bp deléció heterozigóták 5.exonban

82 82 C5: komplement faktor 5 pleiotróp hatás Milyen szerepe lehet asztmában? C5R-antagonistaIL-12 TNFα C5:IL-12Th1

83 83 Humán vizsgálatok 1.Teljes genomszűrés 2.Asszociációs vizsgálatok 3.Pozícionális klónozás

84 84 Teljes genomszűrés Eddig: 16 szűrés 12 populáción 20 régióval találtak kapcsolatot Mikroszatelliták

85 85 Asztma genomszűrések eredményei

86 86 Példa genomszűrésre MARIE-HÉLÈNE DIZIER, et al. Genome Screen for Asthma and Related Phenotypes in the French EGEA Study Am J Respir Crit Care Med Vol 162. pp 1812–1818, 2000 Epidemiological Study on the Genetics and Environment of Asthma, Bronchial Hyperresponsiveness, and Atopy (EGEA): francia genomszűrés 107 „nukleáris” családot vizsgáltak, ahol legalább 2 testvérnek volt asztmája (493 résztvevő): sib pair analízis 254 mikroszatellita marker, 13 cM felbontás 2 lépcsős stratégia: 46 család először, 70% markerrel 61 család másodszor QT: bőrallergia teszt (skin prick teszt), IgE, eozinofilszám, bronchial responsiveness

87 87 17-es kromoszó- ma, asztma 11-es kromoszó- ma; IgE szint

88 88 Jelölt gének Asszociációs vizsgálatok

89 89 Asszociáció egy statisztikai kijelentés: az adott allél szignifikánsan gyakrabban fordul elő együtt az adott fenotípussal, mint az várható. SNP-k! Pozitív asszociáció oka lehet: –Direkt hatás: a vizsgált allél okozza a betegséget –LD: kapcsoltság van a vizsgált marker és a betegséget okozó gén között. –Természetes szelekció. Az illető allél megnöveli a túlélés esélyét a tanulmányozott betegséggel szemben –Populációs rétegződés (population stratification): egyes népcsoportokban bizonyos allélok gyakrabban fordulnak elő. Pl. evőpálcika gén (HLA-A1 gyakoribb a kínaiakban)

90 90 Pozitív asszociáció oka lehet (folyt.) Statisztikai hiba (egyes típusú): a kérdések számával korrigálni kell a p-t. P=0,05 azt jelenti, hogy 95% a valószínűsége hogy az allél asszociál a kérdéses betegséggel.Megfordítva: 5%, ami azt jelenti, hogy 20 vizsgálatból csak egyszer tévedünk. De ha 50 allélt vizsgálunk akkor már nagy az esély, hogy hamis pozitívat is kapunk  Bonferroni korrekció: a szükséges p = 0,05/a kérdések száma.

91 91 Population admixture: (hozzákeveredés) Olyan populációkat vizsgálunk együtt, akik különböző genetikai háttérrel rendelkeznek (Pl.: afrikai, fehér: magas vérnyomás): az egyes populációkra a betegséget okozó specifikus genetikai variációk elveszhetnek (felhigúlnak). Vagy: a vizsgált populációban vannak olyanok, akik kevert genetikai háttérrel rendelkeznek (pl.: kaukázusi “fenotípusú” fekete (afrikai) nagymamával, vagy roma egyén akinek ősei között kaukázusiak is voltak, stb. Kontroll csoport megválasztása nagyon fontos: ugyanolyan populációs rétegződéssel kell rendelkeznie (etnikum, nem, kor, környezet stb.) mint a betegcsoportnak.

92 92 Amish –szegregációs analízis, IgE, Eos.

93 93 5q31-q33 IL-4, IL-13: B sejtek switch  Th2 válasz kiváltása Az IL-4 gén közelében elhelyezkedő mikroszatellita marker és a nem-specifikus (össz) IgE szint között szoros összefüggést találtak. IL-4-589*T homozigótaságot asztmával, rhinitissel és atópiával hozták összefüggésbe. Az IL-13 több polimorfizmusa asszociált emelkedett IgE szinttel. promoter régió: –1111 :szignifikáns kapcsoltságot mutatott asztmával, légúti hiperreaktivitással és pozitív bőrpróbával. IL-13 Arg110Gln: erősebben kötődik receptorához, emelkedett IL-13 és IgE szint, asztma.

94 94 IL-13 Arg110Gln polimorfizmus szignifikánsan gyakrabban (P=0,007) fordul elő asztmában (Th2-es betegség), mint juvenilis arthritisben (JIA, Th1-es betegség)

95 95 5q31-q33 IL-5: Eozinophil felszabadítása a csontvelőből, eotaxin (eozinofil kemoattraktáns) termelés fokozása  Asztma, bronchiális hiperreaktivitás, SNP-t nem találtak. IL-9: T sejt proliferáció, hízósejt differenciálódás és proliferáció. CD14: Bakteriális LPS kötő receptor

96 96 LPS szerkezete Gram negatív baktérium sejtmembránja és sejtfala

97 97 CD14: Bakteriális LPS kötő receptor Szerepet játszik a Th1/Th2 egyensúly kialakulásában. CD14 kötés IL-12 termelést vált ki  élet korai szakaszában Th1 válasz kialakulása C/T polimorfizmus: „TT”: Nő a sCD14 szint (s= solubilis), nő a CD14 sűrűség monocitákon, csökken az IgE szint (vs „CC”).  Th1 irány. A CD14-LPS kapcsolat magyarázhatja a gyermekkori fertőzés és az atópia közötti inverz kapcsolatot.

98 98

99 99 TIM1-TIM3: Receptorok, befolyásolják a Th1 (TIM3) és Th2 (TIM1) sejtek kialakulását. TIM1: Hepatitis-A vírus receptora is. Vírusfertőzés véd az asztma ellen.

100 100 6p21.3 MHC tartomány: MHC II (HLA-D): allergénpeptidek prezentációja a “jobb” vagy “rosszabb” bemutatás, más citokineket termelő Th sejtek aktivációját, tehát erősebb vagy gyengébb allergiás immunválaszt eredményez. Parlagfű Amb5 allergénjére reagáló fehérek 97,5%-a: DR2.2; nem reagáló: 22% DR2.2; (Amb6, Der1 (poratka allergénje) és a Der2-vel kapcsolatban is találtak hasonlókat.) TNFa: Gyulladási választ közvetítése  Asztma TNFa -308 G/A promóter polimorfizmus: ‘A’ allél  magasabb expresszió és TNFa szint

101 101 11q13 FcεRI- β : bazofil, Ds, hízósejt Ile181Leu: Atópia, asztma (?) Glu237Gly: asztma, BHR (?) Anyai öröklődés CC16

102 102 CC16 Clara cell protein 16: bronchusokban szekretálódik, BAL összfehérjéjének 7%-a, légúti gyulladást szabályozza. CC16 KO egér: fokozott gyulladási válasz. 38A/G polimorfizmus az 1.exon nemkódoló régiójában. 38AA 6,9x, 38AG 4,2x asztma kockázat.

103 103 16p21 IL-4R:IL-4-nek (és az α alegység az IL-13-nak is) receptora  Atópia, asztma Ile50Val (I75V, ha a szignálpeptidet beleszámolják) az extracelluláris doménben helyezkedik el, valin esetén a receptor erősebben köti az IL-4-t. (R) A Glu576Arg a jelátviteli intermedierekhez való kötődést változtatja meg. (D) Mindkét esetben a receptor felerősödött jelátvitelét tapasztalták. Haplotípusban a legerősebb a hatás (V50-R576)

104 104 IL-4-re adott válasz nagysága

105 105 17q11.2 Kemokinek: eotaxin, RANTES, MCP-1: Leukociták gyulladáshoz vonzása  Asztma, AEDS Eotaxin: 67 G/A ala/thr asztmára való hajlam: - betegség súlyossága: + „A”: csökkent az eotaxin szekréció alacsonyabb az eozinofilszám és jobbak a tüdőfunkciós értékek.

106 106 Rantes -403 C/G AEDS, asztma, -28 G/A súlyos asztma (Japán és kínai populációk) MCP A/G: magasabb MCP-1 expresszió a G alléllel. (CCR2-MCP1 Th0 Th2)

107 107 MCP A/G vizsgálata asztmában és allergiában. A G allél szignifikánsan gyakrabban fordult elő asztmásokban, mint nem-asztmásokban (34,4% vs 21.1%) Szalai C, Kozma GT, Nagy A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polymorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol 2001 Sep;108(3):

108 108 “Asztma-gének” azonosítása pozícionális klónozással

109 109 Teljes genomszűrés után a jelölt régió szűkítése sűrűbben elhelyezkedő mikroszatellita markerekkel (szokásos QT-k: IgE, AHR) A leszűkített jelölt régióban SNP-k keresése (pl. 5 beteg-5 egészséges megszekvenálásával) LD-k keresése az SNP-k között: haplotípusok azonosítása Haplotípusok asszociációs vizsgálata különböző populációkon asztmával (pl.: TDT)

110 110 A leszűkített, asszociáló területen gének keresése adatbankokban Gének expressziójának vizsgálata egér tüdőben (pl. asztmás vs egészséges) Kiválasztott gén(ek) funkcionális vizsgálata

111 as kromoszóma 460 asztmás testvért tartalmazó család teljes genomszűrése, majd a legmagasabb LOD értéket mutató régióban jelölt régió asszociációs vizsgálat. A használt QT-k: asztma, BHR, asztma+ IgE Van Eerdewegh P. és mtsai. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. Nature. 2002; 418:

112 112 Linkage analysis and gene content of chromosome 20p13. a, lod score plots for four phenotypes: asthma (red), asthma and BHR (black), asthma and total IgE (blue) and asthma and specific IgE (green).

113 113 1 LOD score esés: 95% CI: 4,28cM = 2,5 Mb 40 gén azonosítása 23 génben 135 SNP összehasonlítása 130 IBD és 230 kontroll-ban. 5 SNP ami asszociációt mutatott: megerősítés TDT teszttel a teljes populációban (2000 páciens) 8 haplotípus asszociált asztmával Különböző populációkban (Afrikai amerikai, US fehér, US spanyol, holland fehér, UK, német) más SNP-k és más haplotípusok asszociáltak asztmával. ADAM33 asszociált: 185kb LD intervallum

114 114 ADAM33 expressziója a tüdő különböző sejtjeiben RT–PCR analysis of the expression of ADAM33 in five different lung primary cell types and whole lung. Marker, 100-bp ladder. Lanes containing primers from ADAM33 are labelled a, lanes containing primers from the ORF of  -actin are labelled b.

115 115 ADAM33: -Zn-függő metalloproteináz, -tüdőben, a simaizmokban és a fibroblastokban expresszálódik. Bár pontos funkciója még nem tisztázott, feltételezik, hogy szerepet játszhat a bronchusok kontraktilitásában és/vagy befolyásolhatja a bronchiális remodelling folyamatát.

116 116 Genomszűrés eredménye a 6p21-es régióban HLA-G gén: új asztmagén (2005) pozícionális klónozással Ezek a gének találhatók ebben a régióban

117 117 HLA-G Fő szerepe: gátolja a magzat kilökődését terhességben Gátolja a Th1-es immunválaszt -964 A/G: -964 AA gyerekek 60% atópiás, a GG gyerekek 41% atópiás -964 GG gyerekek akkor hajlamosak bronchiális hiperreakcióra, ha az anyjuknak is van. Asztmás anyák, -964 GG gyerekek 56%-a volt asztmás nem asztmás anyák GG gyerekeinek 26%-ának volt asztmája. Az apákkal nem volt ilyen összefüggés.

118 118 Susan Colilla, et al. Evidence for gene-environment interactions in a linkage study of asthma and smoking exposure. J Allergy Clin Immunol 2003;111: Gén-környezetkölcsönhatás Gén-környezet kölcsönhatás

119 119 Probléma A dohányfüst expozíciónak kitett csecsemőkben nőtt-e a későbbi asztma kialakulásának kockázata, és ha igen, azt milyen kromoszómarégiókon található gének befolyásolták? Gyermekkori asztma Csecsemőkori passzív dohányzás Genetikai markerek? Legmagasabb LOD? ? ?

120 120 Módszer Collaborative Study for the Genetics of Asthma (CSGA); USA-fehéreket vizsgált 144 család, melyben legalább egy asztmás testvérpár van, több család 3 generációs. Kérdés dohányzott-e valaki a családban amikor kisbaba volt? 323 markert vizsgáltak autoszómákon

121 121 Az asztmások 38%-ának volt dohányzó szülője. USA-ban a dohányzás prevalenciája kb. 25%. Eredmények/válasz

122 122 Eredmények/genomszűrés 1p 5q 17p Gyermekkori asztma - Csecsemőkori passzív dohányzás - Genetikai markerek? Legmagasabb LOD? ? ?  2-AR,IL-4,IL-13

123 123 Gén-környezet asszociációs vizsgálat (dohányzás-asztma) 5q32:  2 adrenerg receptor: stimulációja bronchodilatáció Eredmény: Arg16Gly: asztmások 46%, kontrollok 28% arginin homozigóta Az arginin-16 homozigóta dohányzóknak közel 8- szoros az esélyük arra, hogy asztmásak legyenek, összehasonlítva a nemdohányzó glicin-16 homozigótákkal.

124 124  2 adrenoreceptor gén polimorfizmus és az elszívott doboz cigaretta mennyiségének hatása az asztma kockázatára. Minél többet dohányzik az arg-16 homozigóta, annál nagyobb az esélye, hogy asztmás lesz. A többi genotípusúnál nem volt ilyen összefüggés. (*jelenti a szignifikáns különbséget)

125 125 Magyarázat: Arg: magasabb receptorszám De! Jobban reagál dohányfüstre (  2 agonista kezelésre). Hatása vsz. a receptorszám downregulációja. (gly/gly szint alá)


Letölteni ppt "1 Allergiás asztma genomikai háttere 2007. november 14. Ungvári Ildikó – SE, GSII."

Hasonló előadás


Google Hirdetések