BIOPROCESSING „BIO-FELDOLGOZÁS”.

Az előadások a következő témára: "BIOPROCESSING „BIO-FELDOLGOZÁS”."— Előadás másolata:

1 BIOPROCESSING „BIO-FELDOLGOZÁS”

2 Ipari biotechnológia kulcslépései
Nyersanyag Upstream processing: a nyersanyag előkészítése a fermentációra, vagy transzformációra Nyersanyag előkészítés Fermentáció, biotranszformáció Fermentáció,transzformá-ció: bioreaktorokban sejtszaporítás, antibiotikum, fehérje, stb. előállítás termék kinyerés, kiszerelés Downstream processing: a kívánt termék tisztítása, kiszerelése Termék

3 1. Upstream 2. Downstream - tápanyagok - sterilizálás - oxigénellátás
- bioreaktorok - tápanyagok - sterilizálás - oxigénellátás - aerob/anaerob fermentálás 2. Downstream - sejt izolálás - feltárás - extrakció - fehérje tisztítás - kiszerelés - melléktermékek, hulladék kezelés

4 Fermentáció A gyógyszer-, élelmiszer-, és vegyiparban használt (bio-) termékek előállításában a mikrobiális fermentációknak nagy jelentőségük van Fermentáció hatékonysága sajnos gyakran elmarad a teoretikus maximumtól Mikroba fiziológia Rekombináns sejtekkel történő fermentációk Mikrobiális konverziók – fermentáció Enzimatikus folyamatokon alapuló konverzió – biokonverzió Fermentor– reaktor, melyet mikrobiális konverziókra haszn.

5 Fermentációs eljárások típusai
Nyílt és zárt rendszerek Szakaszos fermentáció (Batch) a reaktánsokat (tápanyagok, sejtinokulum, gázok – folyamatos levegőztetés) együtt visszük a rdsz-be a fermentáció megkezdése előtt alapvetően zárt rdsz térfogat állandó Egyszerű eljárás, de termékgátlás ill. szubsztrát gátlás lehetséges Rátáplálásos szakaszos fermentáció (Fed-batch) a tápanyagokat folyamatosan adagoljuk (szubsztrát gátlás elkerülése) a térfogat nő, mert nincs elvezetés Folytonos fermentáció (continuous) nyitott rdsz amennyi tápanyagot bejuttatunk, annyi térfogatnyit el is veszünk paraméterek állandóak Félfolytonos fermentáció (semicontinuous) szakaszos fermentációk sorozata, melyben a fermentlé kb 10%-át a fermentorban hagyjuk, és ehhez adjuk a friss tápanyagokat

6 bioreaktorok Központi szerep, a bioreakciók helyszíne
Fontos a sejt kinetika, anyagtranszfer, folyadék keveredés a bioreaktor tervezéshez Bioreaktor – hardware és software szabályozás, a mikroorg. számára fontos környezeti faktorok szinten tarthatók Kultúra paraméterei: hőmérséklet, keverési sebesség, nyomás, gázáram, pH, pO2, esetleg pCO2, hígulás mértéke Nagy felbontású (elsősorban laboratóriumi, az optimalizáláshoz) bioreaktorokba lehet on-line optikai denzitás mérés, szubsztrát konc. meghat.

7

8 Bioreaktor konfigurációk
A bioreaktor (fermentor) egy edény, melyben a biológiai reakciókat kivitelezzük: mikroorganizmus szaporítása, enzim- vagy immobilizált sejtes reakciók, szövettenyészetek méret: 0, l üveg-rozsdamentes acél, esetleg műanyag Alapvető paraméterek nyomon-követhetők Mintavételezési lehetőség Kevertetés -nyíróerők

9 Bioreaktor konfigurációk
Görgetett edény Ált. műanyagból Horizontális kialakítású, lassú keveréssel Megfelelő levegőztetés, anyageloszlás érhető el A sejtek a henger belső felszínéhez tapadva szaporodnak, nem lepi el folyamatosan a tápoldat A töltet a henger térf. max 30%-a lehet Olcsó, de a kontroll, és monitor nem hatékony Szabályozó egység Bioreaktor edény Görgető rendszer

10 Bioreaktor konfigurációk
Kevertetett tank bioreaktorok Leggyakrabban használt típus Mechanikus keverő rdsz-rel ellátott Rozsdamentes acél (kisebb térf-nál lehet üveg) Magasság:átmérő arány (1:1, 3:1) Keverés keverőlapátokkal, azok kialakítása a nyíróerők szempont-jából fontos Levegőztetés megoldása Sejtek denzitása ált sejt/ml, de ez javítható akár több nagyságrenddel is Mérete akármeddig nem növelhető a keverés, oxigénellátás, hőmérséklet tartás miatt Kevert tankreaktor (angol: stirred tank bioreactor ‘STB’)

11 Bioreaktor konfigurációk
távozógáz Belső cső elem a gáz áramlás biztosítására Gáz buborék Gáz elosztó áramlásmérő Gáz beinjektálása Air-lift bioreaktorok Egyszerű, olcsó A reaktor belsejében egy központi cső, un. emelő (riser), és egy külső hengeres gyűrű un. levezetőcső (downcomer) Fertőzés veszély is csökken Sejtek denzitása ált. 106 sejt/ml

12 Bioreaktor konfigurációk
Fluid-ágyas bioreaktor Hordozó, sejtaggretátok, kisebb térfogat (max 100 L) nagy sejtmennyiséggel – szuszpendált és kitapadó sejtek is Transzport folyamatok - nem elég hatékony Fejlesztés kollagén mikrohordozóval jó eredmények Reciklizáló cső Sejtek denzitása ált. 108 sejt/ml

13 Bioreaktor konfigurációk
Üreges szálas-bioreaktorok Egyszerű, de max néhány liter Kapilláris szálak egy henger testben, mindkét végén tapadnak A sejtek a kapillárisok közötti térben szaporodnak (szövetszerű) Főleg humán sejtkultúrák számára Sejtek denzitása 108 sejt/ml Termék visz. tisztán nyerhető

14 Bioreaktor konfigurációk
Fix ágyas bioreaktorok A sejtek hordozóhoz (pl. aktív szén) kötötten, vagy polimerbe csomagoltan Fluid ágyassal szemben előny a stabilitás Hátránya, hogy a transzport folyamatok mértéke kisebb, grádiens alakulhat ki a bioreaktorban (nem lesz homogén a rdsz) Sejtek denzitása ált sejt/ml Termék kinyerése nehézkesebb Kerámia ágyas bioreaktorok Kerámia hordozó, újrahasználható, költséghatékony Jó minőség, hőmérséklet tolerancia Széles körű felhasználás Inhomogenitás lehet a reaktorban Sejtek denzitása ált sejt/ml

15 keverés Mechanikus propellerek segítségével
Levegő áramoltatás segítségével Külső hurok/ forgatás segítségével bioreaktor termék hőcserélő

16 keverés Feladata a megfelelő anyagtranszport fenntartása, azaz a beáramló levegő, a tápoldatban oldott (vagy nem oldott) tápanyagok, és a keletkező termékek egyenletes eloszlatása Az egyes oldatok viszkozitása szintén befolyásolja a keverés módját, mértékét. Ez az időben változhat, egyrészt a szaporodó mikróbák, valamint a keletkező termék miatt. A kevertetés mértéke akármeddig nem növelhető a nyíróerők miatt A keverés sebességét és a levegőztetés sebességét egymást figyelembe véve kell optimalizálni (ne alakuljanak ki légüregek)

17 Propeller fajták

18 levegőztetés Eltérő oxigénigény aerob/anaerob szaporítás
baktériumok/gombák enzimes/sejtes folyamatok Oldott oxigén szint oldhatóság mértéke hőmérséklet függő Buborék méret túl nagy buborék – hiába juttatunk sok levegőt be, nem hasznosul intenzív keveréssel lehet apró buborékokat nyerni eleve apró buborékképzés - pezsegtetés belső külső

19 oxigénellátás

20 tápközeg Szilárd v. folyékony Természetes, félszintetikus, szintetikus
Tápanyagok: Szén-, energiaforrás Nitrogénforrás, egyéb ásványi anyagok Mikroelemek Vitaminok Növekedési faktorok

21 Szén-, és energiaforrások
Természetes: melasz: a cukorgyártás mellékterméke. ~ 50% cukortartalom, de emellett jelentős nitrogénforrás is sajt/tej permeátum: 6-7% szárazanyagtartalom, főleg laktóz, kevés zsír, fehérje, ásványianyagok Magáztató folyadék (corn steep liquor-CSL): a magok nedves őrlése során keletkezik, cukrok és kismolekulasúlyú N tartalmú vegyületek Manióka v. cassava: 20-40% keményítő, kevés fehérje, zsír Bagasse: cukornádból a cukor kinyerése után visszamaradó rostos anyag

22 Szén-, és energiaforrások
Drágább, de természetes alapú alapanyagok: húskivonat: fehérjéket, aminosavakat tartalmaz. Húsleves bepárlásával állítják elő. Lekvárszerű illetve por alakú pepton: fehérjék savas vagy enzimatikus hidrolízisével állítják elő. Vízben könnyen oldódik. A fehérjék tripszines lebontásával (mely egészen az aminosavakig megy) keletkező magas triptofán tartalmú pepton a Trypton Élesztőkivonat Pontos összetételük nem mindig ismert, változhat, ezért pl. laborban a kísérletek kivitelezése során inkább jól definiált alapanyagokat használunk

23 Nitrogén források Szervetlen: nitrát sók, ammónium sók Szerves
Kukoricalekvár: a kukoricaszem áztatása során keletkező áztatólé 50%-ra töményítve Húskivonat Pepton, tripton

24 egyebek Szervetlen ionok: Növekedési faktorok: Szelektív ágensek:
Foszfor, kén, vas, nyomelemek Növekedési faktorok: melyekre a mikróbáknak szükségük van szaporodásukhoz, de szintetizálni nem tudják Szelektív ágensek: Specifikusak az adott mikrobára, másokra gátló hatásúak Habzás gátlók csökkentik a felületi feszültséget (a folyadék-gáz határfelületen), ennek következtében a légbuborékok átmérője kisebb lesz Szelektív körülmények Pl. szén-, nitrogén forrás limitáció- elősegítheti bizonyos anyagok intenzívebb termelődését, extracelluláris termékek képzése Van elég szénforrás, de kevés a nitrogén forrás poliszaharid, PHA felhalmozás (akkumuláció) lehet

25 sterilezés (csíramentesítés)
Szennyező mikroorganizmusok elpusztítása a fermentáció előtt Hőkezelés, sugárzás (UV, gamma), kémiai ágensek, ultrahang, szűrés Hőkezelés gőzzel, ha nyomást is tudunk alkalmazni, jobb a hatékonyság, rövidebb idő elég (teszt organizmus Bacillus stearothermophilus) Spórák elpusztítása érdekében néha többszörös sterilezés szükséges, ez azonban károsíthatja a tápanyagokat (pl. cukrok karamellizálódnak)

26 sterilezés (csíramentesítés)
Tápoldat + gáz sterilezés Folyadék - szűrés/ülepítés - kémiai-, hő- inaktiválás 1. Szűréssel: - cellulóz alapú filterek, pórus átmérő igény szerint változó 0,2 - 0,45 mm 2. Inaktiválással: - hőkezelés: teszt mikróba: Bacillus stearothermophilus     hőérzékeny tápkomponensek 3. Kémiai: hypo, formaldehid oxidálószerek (pl. H2O2, peroxiecetsav)

27 sterilezés (csíramentesítés)
Gáz - szűrés - UV, röntgen - kémiai Mi szennyez?: penészgombák >> egyebek fágok kiszűrése még ma sem megoldott Szűrés filterek –hidrofób jelleg formaldehiddel átitatott üveggyapot kritikus sebesség/perc hatásfok igény: 0,5 - 1,5 térf. levegő/perc folyadék térfogatonként

28 Fermentációs termékek
Sejt pl. élesztő, SCP Elsődleges metabolitok pl. citromsav, etanol, glutaminsav (ált L kevertetett tank fermentorokban) Másodlagos metabolitok pl. antibiotikumok (ált – L térfogatban) Enzimek (főleg extracelluláris, pl. amilázok, proteázok, lipázok m3 térf) Terápiás fehérjék pl. interferon, növekedési hormon, inzulin… Vakcinák pl. hepatitis-, szamárköhögés ellen

29 termékkinyerés Centrifugálás, ülepítés, szűrés - sejtek összegyűjtése
Ha sejtalkotót, vagy intracelluláris terméket áll. elő szükséges a sejtek feltárása: mechanikai: örlő malom, ultrahang, nyomás kémiai: szerves oldószerek, detergensek enzimatikus: lizozim (G+ baktériumokra, G- esetén SDS-sel együtt) Extrakció, filtráció, adszorbció, kicsapás Kis molekulák kinyerése pl. folyadék-folyadék extrakció Oldószeres –hidrofób termék esetén Detergens segítségével Filtráció – szűrőn áteresztjük, dializis Adszorbció - hordozóhoz kötjük a kinyerni kívánt anyagot Kicsapás – csapadékot képzünk pl. magas sókonc-val (pl. ammónium-szulfátos) Tisztítás Kromatográfia (álló- és mozgó fázis) Gélfiltráció Elúciós kromatográfia (ioncserés, hidrofób, affinitás)

30 Sejtek összegyűjtése, koncentrálása centrifugálással

31 Sejtek feltárása ultrahang (1), detergens (2), nyomás (3), örlő malom (4) segítségével

32 Kromatográfiás folyamatok
Kromatográfia elválasztási módszer. Kromatográfiában az állófázis (mely ált. porózus, nagy felülettel rendelk. anyag) és a mozgófázis (ált. folyadék vagy gáz) között megoszlanak az anyagok egyensúlyi állandójuk szerint. A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a befecskendezési ponttól a detektorig (érzékelő berendezés) jut. Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később távoznak, mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

33 Kromatográfia - gélfiltráció
Molekula méret szerinti elválasztás Töltet: porózus szemcsék Természetes polimerek (pl. dextrán, agaróz) Szintetikus polimerek (pl. poliakrilamid)

34 Kromatográfia - Hidrofób kromatográfia
Magas sókoncentráció mellett fehérjék képesek/hajlamosak poláros felszínhez kötődni A sókonc. csökkentésével a fehérjék leválnak a hordozóról, eltérő sókonc-nál hidrofób tulajdonságuknak megfelelően

35 Kromatográfia - Affinitás kromatográfia
Gélágy ligandja specifikus affinitással bír az elválasztandó anyaghoz Az adszorbeált termék leválasztása pl. sókoncentráció, pH változtatás, vagy akár a ligandot az eluáló szerhez adjuk

36 Kromatográfia - Ioncserés kromatográfia
Erős kationcserélő oszlop: a negatív töltésű állófázison pozitív ionokat választunk el. Erős anioncserélő oszlop: pozitív töltésű állófázison negatív ionokat választunk el. Ioncserélő kapacitás függ az állófázison kötött töltések számától. A termék leválasztására ellenionokat tart-ó eluenst haszn.

37 kiszerelés Kristályosítás Szárítás Liofilizálás Csomagolás
A kristály - csak egyféle anyag alkothatja a kristályrácsot Szárítás ált. nagy felületen forró levegővel Liofilizálás hőérzékeny termékekre: vitaminok, enzimek, vakcinák, mikróbák, gyógyhatású fehérjék Csomagolás Hulladékkezelés