Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el:

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el:"— Előadás másolata:

1 1 A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el:

2 2

3 3

4 4

5 5 A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK ELŐNYEI Fő ok: Ha egy fehérjére nagy mennyiségben van szükség, és a természetben csak kis mennyiségben fordul elő, vagy az eredeti sejtvonal nehezen kezelhető, belõle fehérje csak körülményesen nyerhető. KÖZVETLEN FELHASZNÁLÁS IPARI, proteázok, szénhidrátbontó enzimek, lipázok, polimerázok,bioaktív peptidek, fehérjék, hormonok, farmakológiai, gyógyászati felhasználásra KUTATÁSI CÉLOKRA biokémiai és biofizikai vizsgálati módszerek, 3 dimenziós röntgenszerkezet, mutációs analízis, FELTÉTEL: A felhasználás előtt igazolni kell, hogy az eredeti fehérje és a rekombináns megfelelője biológiailag ekvivalens

6 6

7 7 DNARNA 1 OH 2 U H 3

8 8 A DNS felépítése

9 9 DNS-olvadáspont Streptococcus DNS olvadási görbéje. T m = az a hőmérséklet ahol a 50% DNS megolvadt.

10 10 A DNS G-C tartalma és olvadáspontja közötti összefüggés

11 11 Annealing vagy Hibridizáció Lehet DNS - DNS DNS - RNS RNS - RNS

12 12 “A” DNS“B” DNS“Z” DNS DNS-struktúrák

13 13

14 14

15 15 DNS etanollal, izopropilalkohollal kicsapható Kromoszómális DNS nagy, makroszkopikus molekula kiemelhető Minél nagyobb egy DNS, annál könnyebben törik. Kb. 20 kb – osnál nagyobb DNS erős fizikai behatásnak (vortexes kevertetés) nem tehető ki! hordozó Egyéb tisztítási módszerek kromatográfia, - ioncserés DEAE (dietil-aminoetil) kötés alacsony, elúció magas sókoncentráció esetén A DNS savas  ionos kölcsönhatás - szilikagél alapú elválasztás magas sókoncentráció mellett felkötődik a DNS, alacsony sókoncentrációnál eluálódik

16 16 - CsCl sűrűséggradiens centrifugálás adott koncetrációjú CsCl oldat centrifugálás során grádienst képez, a DNS a saját sűrűségének megfelelő helyre vándorol és ott megáll. különböző konformációjú DNS-k szétválaszthatóak, nagy tisztaság RNS tisztítása RNS nagyon könnyen degradálódik, RNázok stabilak a tisztítás során RNáz mentesíteni kell mindent DEPC: dietil pirokarbonát

17 17 sok eltérő protokol, ma univerzálisan használható rendszer a guanidium isotiocianát-fenol- kloroform oldattal történő extrakció egy lépésben sejtfeltárás és szerves-vizes folyadék fázisú extrakció. A vizes fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi kromoszómális DNS szennyezést, DNázI kezeléssel eltávolítható RNS tisztítása guanidin és izotiociánsav sója

18 18 mRNS tisztítás eukarióták esetén stabil poliA farok TTTTTTTTTT- hordozóhordozó AAAAAAAAA mRNS tRNS rRNS AAAAAAAAA mRNS TTTTTTTTTT- hordozóhordozó AAAAAAAAA mRNS magas só alacsony só

19 19 DNS ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZIS denaturáló nem-denaturáló lúgos, (DNS, agaróz) formaldehid, glioxál, DMSO (RNS, agaróz) urea (DNS, akrilamid) méret > 50 kb 100bp-50 kb < 1000 bp Mátrix agaróz agaróz % poliakrilamid technika pulzáló gélelektroforézis hagyományos gélelektroforézis (5-20%) hagyományos LÁTHATÓVÁ TÉTEL: etídium bromid, interkaláló festék  nem-denturáló körülmények, első sorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is. A DNS 254 nm-en elnyel  energia a festékre  590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni. Érzékenység kb 10 ng. Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülmény között radioaktivitás: minden körülmény között, 35 S, 33 P, 32 P beta sugárzók Nincs roncsoló ágens

20 20 etidium bromid & DNS Agaróz szerkezete

21 21 Horizontális gélelektroforézis

22 22 Géldokumentáció

23 23

24 24 Poliakrilamid gél futtató berendezés

25 25 Vertikális gélelektroforézis (PAGE)

26 26 DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL - közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t - a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével AGARÓZ - dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis a kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos kicsapással, univerzális, széles mérettartomány - - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80 o C-on megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális - kromatográfiás módszerek 6M NaI mellett a DNS 55 o C-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik, a mátrix mosása után innen o 55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálható nagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb esetén jó a kitermelés POLIAKRILAMID (PAGE) a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljuk majd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk

27 27 DNS/ RNS MÉRÉSE A különböző nukleotidoknak 260 nm körül erős abszorbanciájuk van. Egyszálú DNS esetén: bázis  (cm 3 /(µmol * cm) dA15.4 dG11.7 dC 7.5 dT 8.8 átlagosan  = 10 (cm 3 /(µmol * cm) Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos. Nagyobb egyszálú, kétszálú DNS-k, RNS-k esetén a bázisok kölcsönhatásamiatt a számítás módosul 1 cm-es küvettában 260 nm-en 1.0 az abszorbanciája 50 µg/ml kettősszálú DNS-t 33 µg/ml egyesszálú DNS-t 40 µg/ml egyesszálú RNS-t tartalmazó oldatnak A fehérjék 280 nm-en nyelnek el. Az A 260nm /A 280nm arány a nukleinsav tisztaságára jellemző Egyéb módszerek: fluoreszcein, kemilumineszcens festékekkel. Érzékenyebb, de fluorimétert igényel. A 260nm /A 280nm  2  tiszta a preparátum A 260nm /A 280nm  1 - 1,5  sok a fehérje szennyezés

28 28


Letölteni ppt "1 A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az alábbi internet címen érhető el:"

Hasonló előadás


Google Hirdetések