Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Dept. of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai Kutatócsoport,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Dept. of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai Kutatócsoport,"— Előadás másolata:

1 Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Dept. of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai Kutatócsoport, SzBK

2 Bioinformatika úgy általában adatbázisok felépítése ezen adathalmazok statisztikai analízise, matematikai értelmezése szabályszerűségek meghatározása szabályok hasznosítása – predikciók pl. funkcióra, rokonságra, eredetre, szerkezetre stb.

3 Bioinformatika úgy általában „összehordott” adatokból építkezünk többnyire elmélet eleinte a gyakorlati hasznosítás majd a végén jön persze ez visszahat az elméletre

4 Mit lehet kiaknázni? genomiális adatbázisok fehérje szekvencia adatbázisok fehérje 3D szerkezeti adatbázisok stb, stb Meghatározó faktor: Mennyire megbízhatóak az adatok?

5 Proteomika A sejt fehérjetartalmának kvalitatív és kvantitatív jellemzése Mi van jelen? Mennyi? Milyen formában? Lokalizáció? Kölcsönhatások? Partnerek?

6 Problémák állandó dinamikus változások hatalmas mennyiségi különbségek igen eltérő fizikai tulajdonságok – még ugyanarra a géntermékre is

7 Még mindig „problémák” Poszt-transzlációs módosítások Idő-, faj-, állapot-, lokalizáció- stb. -függő permanens vs. dinamikus teljes vs. részleges jelentős vs. csekély méretváltozás hidrofil hidrofób Nem árt érteni a biológiához!

8 Láthatóvá tenni a komplexitást... Frakcionálni kell ! 1D-, 2D-, multidimenziós módszerek

9 1D-SDS-PAGE * Minden belemegy a gélbe, de kicsi a felbontás. * Várhatóan fehérje-elegyeket kell analizálni

10 2D elfo 1. dimenzió: izoelektromos fókuszálás → pI szerint - pH 3-10 DE savas vagy bázikus fehérjék NEM fókuszálódnak membrán-fehérjék kicsapódnak – ionos detergens nem használható 2. dimenzió: SDS-PAGE

11 1. spot 7. spot 8. spot 2. spot 3. spot 4. spot 5. spot 6. spot 9. spot pH: proteins 3 proteins 2 proteins 1 protein 4 proteins 1 protein 3 proteins

12 2D elfo másképpen 1. dimenzió: 16 BAC-PAGE (pozitív „fejű” detergens) 2. dimenzió: SDS-PAGE Minden belemegy a gélbe, de átlósan frakcionálódik – kis felbontás

13 Speciális 2D elválasztás 16-BAC SDSSDS Pros3510/14 (71%)33% Pros  734/36 (94%)63% Pros  612/12 (100%)42% Pros28.114/21 (66%)54% Pros2919/23 (83%)59% Pros  213/15 (86%)42% GC /14 (93%)35% ProsMA522/44 (50%)56% Pros2512/15 (80%)50% Pros  318/24 (75%)53% Pros266/15 (40%)46% Pros  511/12 (92%)26% GC /23 (47%)46% l(2) /19 (79%)72%

14 Festés Commassie Brillian Blue – kvanti Ezüst – érzékenyebb, de NEM kvanti Trükkök: funkciós csoportra specifikus festés differenciál festés

15 2D-kromatográfia 1. dimenzió: kation - ioncsere 2. dimenzió: fordított fázisú HPLC Követés: 215 nm-en → peptidkötés Nyilván semmi hidrofób nem érvényesül ilyen körülmények között... Reprodukálhatóság degradálódik az oszlop életkorával!

16 Ki is kell találni mit is válogattunk szét! Edman szekvenálás → N-terminuson blokkolt fehérjékkel, keverékkel nem megy Western-blot → tudni kell, hogy mit keresünk, és kell jó ellenanyag

17 alapötlet Egy bizonyos fehérje adott specificitású enzimmel emésztve szekvenciájára jellemző hasítási termékeket fog produkálni Ha a valóságos emésztményt az adatbázis „in- silico” eredményeivel összevetjük azonosítani tudjuk a fehérjét Az összehasonlítás alapja csak valami biztosan megjósolható és egyértelműen meghatároztató tulajdonság lehet: TÖMEG

18 A tömegspektrometria előnyei alkalmazható keverékekre blokkolt fehérjékre is kovalens módosítások azonosíthatóak

19 Detektálási érzékenység Edman szekvenálás – kb. 1 pmól M MS – kb fmól - 5x M Western blot – kevesebb, mint M

20 MS-alapú Proteomika Fordított bioinformatika: mérési adatok + adatbázisok + algoritmusok → biológiai eredmények Tudni illik valamit az analitikai módszerről

21 Mass Spectrometry 101 Ionokat mérünk Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Electrospray Ionization – többszörösen töltött ionok Nagy vákuumban quadrupole, Time-of-Flight, ioncsapda MS → MH + adatok MS-MS alias CID, CAD, PSD... → szekvencia info

22 Monoizotópos tömeg csak C 12, H 1, N 14, O 16 and S 32 ← 1 C 13 2 C 13

23 Felbontás: m/  m = /0.2 ~ 8000

24 Miért is kell felbontás?

25 Normál peptid, 1000-es felbontás

26 Normál peptid, es felbontás

27 Br-Trp-tartalmú peptid, 1000-es felbontás

28 Br-Trp-tartalmú peptid, es felbontás

29 3+ töltésű peptid, kis felbontás

30 3+ töltésű peptid, nagy felbontás Δ = = kb. 1/

31 Tömegmérés pontossága 0.1 Da mérési hiba egész jó 2 kDa-nál, DE katasztrófális egy kis molekulánál Relatív értéket adjunk meg! pars per million

32 Milyen pontosan tudunk mérni? belső standarddal 20 ppm-en belül ± külső standarddal 200 ppm-en belül ± intakt fehérjékre 0.1%-on belül ± Gyenge jeleknél nem érvényesül a Gauss eloszlás!

33 Emésztési elegy MALDI-spektruma

34 Peptidek ESIMS analízise

35 Intakt fehérjék MALDI-analízise

36 Intakt fehérje ESI-analízise

37 Ha ez így megy, minek egyáltalán emésztgetni? Miért nem mérjük az intakt fehérjéket? preparatív és interpretív akadályok

38 Minta-előkészítés Legyen a fehérje hozzáférhető a hasításra: → denaturálás → diszulfid-hidak bontása Emésztés, kémiai hasítás

39 Specifikus hasítások tripszin - Lys↓ Arg ↓ endoproteáz Lys-C - Lys ↓ endoproteáz Glu-C - Glu ↓ (Asp ↓) endoproteáz Asp-N - ↓Asp (↓Glu) pH kb CNBr (+75 %-os TFA) - Met ↓

40

41

42

43

44 Az analízis Egybemérjünk vagy frakcionáljunk? MALDI vs ESIMS LC-MALDI LC-ESIMS

45 Mennyire kellene pontosan mérni a peptideket ? MH + = ± 0.3 ppm 9 különböző aminosav-összetétel különböző szekvencia 3 különböző elemi összetétel Ile/Leu ThrVal/SerLeu GlyGlu/AlaAsp

46 Miért kell még szekvencia info? Keverékek Kovalens módosítások Izoformák Splice variants És ha nincs bent az adatbázisban?

47 Hogyan tegyünk szert a szükséges információra? Feladat: → meghatározni a komponensek tömegét → egyet fizikailag elkülöníteni → „szétverni” Műszeres megoldás: tandem tömegspektrometria, ionkapu, ioncsapda Fragmentálás: post-source decay (PSD), ütközéses aktiválás (CID/CAD), elektron- befogás (ECD)

48 Peptid fragmentáció NH 2 -CH(R 1 )-CO-NH-CH(R 2 )-CO~ ~CO-NH-CH(R n )-COOH y n-1 y1y1 y n-2 b n-1 b2b2 (72) Ala-Ser-Pro-Asp-Tyr-Arg b i =  gyöksúly + 1 y i =  gyöksúly + 19 A fragmentáció módszer- és készülék- függő!

49 60.04S130.09y 1 -NH y2y b 3 +H 2 O528.25b 4 +H 2 O 70.07R138.07H277.14HR-NH HRE-NH y 4 -NH K147.11y1y RE415.23y 3 -NH m3m R197.10a2a HR423.21HRE569.32y4y R207.09b 2 -H 2 O336.18a 3 -NH y3y m2m K225.10b2b a3a a 4 -NH m4m E258.16RE b 3 -H 2 O482.25a4a m5m H259.13y 2 -NH b 3 -NH b 4 -H 2 O625.33m1m R266.17HR b3b b 4 -NH K269.12RE-NH HRE b4b4 SHREK - Elméleti MALDI-CID spektrum – MS product

50 z1z c2c a3a z3z c4c a2a z2z c3c a4a z4z4 SHREK – elméleti ECD fragmensek Elméleti „spektrum”: → lehetséges fragmensek, egyenlő intenzitással

51 És egy valóságos spektrum

52 bioinformatika = bio + informatika Nem szabad elfelejtenünk, hogy biológiai mintákkal dolgozunk! és kémiailag is aktív vegyületekkel! Az algoritmus lehet tökéletes, csak a biológiai rendszer nem viselkedik!

53 Megtörtént a frakcionálás, az emésztés...Jön az analízis! Mondjuk, MALDI MS-mérés frakcionálatlan, vagy HPLC után → egy jellemző (?) MH + sorozat ↓ MS-Fit Peptide Mass Fingerprint – alapú fehérjeazonosítás Mi lehet a baj? → aspecifikus hasítás, kovalens módosítás, szennyezés stb.

54

55

56

57

58

59 Nem mindig ilyen szép a menyasszony! azaz a PMF-alapú azonosítást meg kell erősíteni MIÉRT??? – lásd előbb és később is... a „vád tanúja”: az MS-MS kísérlet eredménye

60 MS-MS eredményekkel is lehet keresgélni!

61 Független PMF és MS-MS azonosítás az igazi!

62 Elegánsabb az on-line LCMSMS A nanoHPLC oszlopról minden megy a tömegspektrométerbe (250 nL/min) ún. „adatfüggő” adatgyűjtés 1)MS mérés 2)Komputer kiválasztja a legintenzívebb iont 3)MS-MS mérés

63 MS + MS-MS combined total ion current MS MS-MS

64 Lekeresés csak MS-MS adatokkal „script” – az összes MS-MS adatok megfelelő formába rendezve az egyes spektrumokkal független lekeresés az eredményeket viszont fehérjénként összegezzük

65

66

67 Nem igazi adatokhoz, hanem az elméleti spektrumhoz hasonlítunk!

68

69

70

71 Kovalens módosítások detektálása szerencsés esetben találhatunk ilyet is automatizált MS-MS analízissel lekereső programok lehetővé teszik a kovalens módosítások követését

72 Túl sok variációs lehetőség rengeteg félreértelmezést okozhat !

73 Proteomic studies on Schistosoma mansoni G. Knudsen, J.H McKerrow, UCSF * “waterborn” parasitic disease, 200 M people infected worldwide through their skin * Intermediate host – Biomphalaria glabrata * Enzymes in cercaria secretion are the key to infection Illusztráció a teljes (nem faj-specifikus) adatbázis lekeresés előnyéről

74 It was assumed a simple mixture cercaria released from snails, rinsed secretion triggered with skin lipid solution collected, concentrated 1D SDS-PAGE protein-fractionation in-gel digestion with trypsin LC/MS analysis Eksigent/Famous - 75  m ID PepMap column; 300 nL/min flow; water/ACN/0.1% HCOOH mobile phase, gradient elution, QSTAR; 1 sec MS/3 sec CID; single charged and dynamic exclusion

75 What did we find? cercaria surface proteins cercaria elastases, and glycolytic enzymes snail immune response proteins photosynthetic proteins human keratin bovine serum albumin!

76 Where did they come from? contamination from the cercaria SECRETION – the real stuff! contamination from the host lettuce - should we starve the snails? technician lab – should we clean the lab?

77 Eddig csak kvali volt... Kvantitatív proteomika 1) a frakcionálás szintjén Pl. 2D gélek összehasonlítása vizuálisan, komputer programokkal, differenciál festéssel 2) az MS-analízis során

78 Az MS NEM kvantitatív módszer * a különböző molekulák nem egyformán detektálhatók pl. különböző peptidek relatív intenzitása nem tükrözi relatív mennyiségüket * nem minden komponenst detektálunk az elegyekből

79 Hogy lehet ezt legyőzni? csak nagyon hasonló peptidek relatív intenzitását vethetjük össze! 1) Jelöljünk két sejt-populációt hasonlóan, de megkülönböztethetően! 2) Keverjük össze az összes fehérjét! 3) A keveréket emésszük, analizáljuk! És így kvantizhatunk!

80 Hogyan jelölhetünk? ICAT – Cys-oldalláncának alkilezése, könnyű (H 8 ) és nehéz (D 8 ) alkil-csoporttal → amiben nincs Cys, az kiesik → a deuterált vegyület retenciós ideje kicsit hosszabb azonosítás: MS-MS alapon kvanti: relatív intenzitásokból ingadozás: van az 30% is!

81 Hogyan jelölhetünk? SILAC (stable isotope labeling) C 13, N 15, O 18 tápanyaggal visszük be – jelölt aminosav → Olyat kell választani, ami nem alakulhat át más aminosavvá, illetve nem szintetizálódik a sejtben Tripszines emésztéshez Arg a menő! a keveréket frakcionáljuk, emésztjük, analizáljuk azonosítás MS-MS alapon kvanti a relatív intenzitásból

82 Hogyan jelölhetünk? tripszines emésztés H 2 O 18 -ban Két oxigén lép be, minden peptid jelölődik Rengeteg információ Még a szekvenálás is könnyebb, a C- terminális ionok csúsznak DE beszárítás a normál emésztés után, hosszú enzimes inkubáció... → veszteségek, nem specifikus hasítások

83 Hogyan jelölhetünk? iTRAQ ™ (Applied Biosystems) Nagyon ravasz jelölés! amino-csoportra (N-terminus, Lys) 4-féle stabil izotópos szerkezet, azonos additív tömeggel, de különböző fragmensekkel (m/z 114, 115, 116, 117) azonosítás és kvanti az MS-MS adatokból!

84 Hasznos web-oldalak ProteinProspector – MS-BLAST - heidelberg.de/Blast2/msblast.htmlhttp://dove.embl- heidelberg.de/Blast2/msblast.html BLAST - European Bioinformatics Institute - Szekvencia-összehasonlítás - MS kezdőknek - „What is mass spectrometry” -


Letölteni ppt "Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Dept. of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai Kutatócsoport,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések