Higiéniai kontroll vizsgálatok az élelmiszeriparban

Az előadások a következő témára: "Higiéniai kontroll vizsgálatok az élelmiszeriparban"— Előadás másolata:

1 Higiéniai kontroll vizsgálatok az élelmiszeriparban
A fogyasztásra kerülő élelmiszer mikrobiológiai állapotát befolyásoló tényezők: Nyersanyag Feldolgozás körülményei Tárolási feltételek Fogyasztási szokások

2 Az élelmiszer (nyersanyag) és a vele kontaktusba kerülő eszközök, személyek mikrobiológiai terheltségének vizsgálata: A./nyersanyag:  mintavétel  laboratóriumi vizsgálat  eredmény … mikrobaszám/mintaegység B./feldolgozás körülményei: Berendezések felülete (tisztítás-fertőtlenítés után, gyártás előtt…) Levegő (folyamatosan…) Dolgozók (folyamatosan… bőrfelület, ruházat felülete, stb.) C./tárolási feltételek: Csomagolóanyagok felülete (csomagolás előtt…) Makro- és mikroklíma (folyamatosan…) Levegő (folyamatosan…) Tényállás: B. és C. esetben nem vihető közvetlenül minta a laboratóriumba!!!

3 Speciális mintavétel higiéniai kontrollhoz, mikrobaszám detektálásához:
3.1. Felületek esetén A./ Indirekt –Kencés(tamponos) :  lemosás  szuszpendálás laboratóriumi vizsgálat (Millipore-Sampler; Biotes-DIP Slide!) eredmény…mikróbaszám/felületegység

4 Microbial Surface and Liquid Sampling - HYCON® Dip Slides
Vizek Mikrobiológiai szennyezettsége Táptalajjal kétoldalt bevont lemez Kinőtt telepek alapján: mikrobaszám/mm folyadék Szimultán meghatározás: Összcsíra, élesztő, penész v. Összcsíra és kóliformok

5 B./Direkt – Lenyomati kép vizsgálata:
pl. Count-Tact (bioMerieaux – Fr.o.) Hygicult® (Orion Diagn. – Finno.) Biotest Hycon® – Contact slides (Biotest – Németo.) Envirocheck® - Contact slides (Merck – Németo.)

6 HYCON® Contact Slides Felületek baktérium, élesztő és penész számának meghatározására 25 cm2 kontakt felület Standard, szelektív és gyedi táptalajok

7 Envirochek® Rodac (Blister) Plates
Teljes sejtszám meghatározás Élesztő és penész szám meghatározás Vizsgálat menete: Korong kivétele tasakból Konvex agar felületre nyomása (25g/cm2) 10 mp-ig Jelölés Felület tisztítása Inkubálás szabvány szerint

8 Envirocheck® - Contact slides
A kitt kivétele a tubusból az utófertőződés elkerülése mellett. Szilárd felületek esetében: Felületre nyomás (mindkét oldal)

9 Folyadékok esetében: 5-10 mp-ig folyadékba merítés (teljes kittet). Felesleg leszívatása itatóspapírral. Tesztkitt visszahelyezése a tubusba. Jelölés. Inkubálás előírt ideig

10 Eredmények értékelése az összehasonlító kártya (model density card) alapján

11 3.2. Levegő mikrobiológiai vizsgálata:
A./ Szedimentációs (passzív módszer) – meghatározott ideig nyitva hagyott tápközeg-tartalmú petricsészével) Idő (nyitva)  várható csíratartalom függvénye (kb. 20 perc) Inkubáció  tápközegnek megfelelően Eredmény  mikrobaszám/kb. 60 cm2 + a nyitva tartás ideje B./ Beágyazásos (aktív) módszer – a tápközeg felületére fújja a levegőt, max1000 liter Inkubáció  tápközegnek megfelelően Eredmény  mikrobaszám/m3 pl. egyenesáramú ütköztetéses  MAS 100 (Merck – Németo.) centrifugális ütköztetéses  Standard RCS, RCS Plus (Biotest – Németo.)

12 MAS 100 és MAS 100 Eco (egyenesáramú ütköztetéses)
Élelmiszerelőállító üzemek, kórházak stb. levegőjének vizsgálata MAS 100 Eco

13 MAS 100Ex Szélesebb spektrumú alkalmazás (gázok, magas hőmérséklet) Lamináris áramlás 0.45 m/sec Standard petricsésze Programozható  napi monitoring Kapacitás: l

14 Működési elv Mérés folyamata:
Petricsésze (standard méret) előkészítése Táptalaj késülékbe helyezése Levegőátszívatás beindítása Inkubálás Értékelés a paraméterek alapján (idő áramlási seb. Stb.)

15 SAS Super 100 Baktérium, gomba és vírus detektálására
Különböző méretű táptalajok. Kapacitás180 – 1000l

16 Microbial Air Samplers - RCS PLUS and RCS PLUS Explosion-Proof (centrifugális ütköztetéses)
Áramlási sebesség: 50l/min Kapacitás: l

17 Microbial Air Samplers - RCS High Flow
Áramlási sebesség: 1 m3 / 10min Kapacitás: l Hatókör: 10 m

18 Microbial Air Samplers - Agar Media for all RCS Air Samplers

19 Speciális higiéniai kontroll nem mikrobaszám alapján:
 szennyezés maradványok vizsgálata: A./ ATP kimutatás (biolumineszcencia)  Hy-LiteTM(Merck – Németo.) Tejfeldolgozás, húsfeldolgozás, konyhák, hűtőházak, ital előállítás, pékség, halfeldolgozó, stb. Baktériumok és más mikroorganizmusok kimutatása Mikrobiális fertőzés, élelmiszer maradvány, állati termék maradvány az öblítővízben, a felületeken, vagy a személyzeten ATP reakció hőmérsékletfüggő hőmérsékletszabályozó(22°C) Tisztítás-fertőtlenítés előtt és után Rövid idő alatt eredmény (60mp.) Gyors adatkezelés Jó érzékenység

20 Az ATP biolumineszcencia – mérés elve
(Mg2+) (luciferin-luciferáz-AMP) + pirofoszfát ATP+luciferin-luciferáz (luciferin-luciferáz-AMP) (O2) Oxiluciferin+luciferáz+CO2+AMP+fény

21 1 2 3 Felületet a mintavevő tamponnal lemosni Tamponra tapadt minta kioldása a regensbe Behelyezés a luminométerbe A vizsgálat hőmérsékletfüggése

22 Clean Check Program elvén működő ATP meghatározó készülék
Uni-Lite® Xcel Clean Check Program elvén működő ATP meghatározó készülék

23 B./ Protein mérés (kolorimetria)  Swab ‘N’Check (Biotest
– Németo.) Az elv hasonló az ATP méréshez, de itt a minta színreakciót ad a reagenssel. Színintenzitás mérésével kapjuk az eredményt

24 C/ Gyorstesztek klasszikus laboratóriumi analízis kiegészítésére helyszíni mérések eredmények gyorsan rendelkezésre (állnak,helyszíni döntéshozás) laboratóriumban is kitűnően alkalmazhatók A gyorstesztek az alábbi minták vizsgálatára alkalmazhatóak: -ivóvíz -talajvíz -felszíni vizek -ipari vizek -élelmiszerek és takarmányok -talaj ás trágya -biológiai minták

25 Aquamerck® alkamazási területe rendkívül széles a gyorstesztek praktikus kombinációjából egy adott felhasználási terület igényeinek megfelelő minilabor állítható össze vízanalitikai vizsgálatok (pH, ammónium,nitrit, nitrát, összes keménység, oldott oxigén tartalom) titrimetriás vagy kolorimetrikus elven működnek

26 Reflectoquant® reflektometriás koncentráció mérés analitikai tesztcsíkok és küvetta tesztek reflektometriás kiértékelésével •  ivóvíz •  talajvíz •  felszíni vizek •  ipari vizek •  élelmiszerek (bor) és takarmányok •  talaj és trágya •  biológiai minták (tej)

27 Spectroquant® Fotometriás elven működő készülék Megfelel a GLP szerinti analízis elvárásainak zavarosság okozta eltérés szimultán méréssel korrigálható. Víz-és szennyvíz analitikában Megválasztható, hogy mely paraméterekre és milyen időközönként kívánunk ellenőrző vizsgálatot végezni spektrofotométer nm tartományban spektrum felvétel

28 Merckoquant® Kémiai elemek kimutatására alkalmas tesztrendszer Kimutatható elemek és vegyületek: Alumínium Kobalt Arzén Aszkorbinsav Kálcium Klór Formaldehid Kromát cianid

29 Toxalert élő organizmuskat tartalmaznak (világító baktériumokat) baktériumok fényt bocsájtanak ki (biolumineszcencia) A toxicitás a baktériumok biolumineszcenciájának csökkenésével határozható meg a biolumineszcencia összefügg a sejtmetabolizmussal toxikus anyag megjelenése  sejt állapotában változás  biolumineszcencia csökkenése  fénykibocsátó képesség változása vizek, szennyvizek, folyók, és talajvizek toxicitásának meghatározása

30 SOLID PHASE IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TESTS

31 4/1998. (XI.11.) EüM rendelet 3. Számú melléklete
Rendeleti háttér 4/1998. (XI.11.) EüM rendelet 3. Számú melléklete Az élelmiszerekkel kapcsolatos tevékenység során használt berendezés, felszerelés, gép, munkaeszköz, élelmiszerrel közvetlenül érintkező munkafelület és csomagolóanyag, valamint a személyi tisztaság élelmiszerbiztonsági mikrobiológiai vizsgálata Mintavétel Megítélés 2.1. Csomagolóanyag 2.2. Felszerelés, munkaeszköz, edényzet, munkafelület 2.3. Személyi tisztaság

32 Automatizált mikrobiológiai vizsgálati eljárások
Hagyományos séma Mikrobaszám meghatározás: Minta bemérés  homogenizálás  higítási sor  leoltás  inkubálás  értékelés //  megerősítő reakciók (morfológiai, biokémiai)  inkubálás  értékelés Adott mikroorganizmus jelenlét/hiány kimutatása: Minta bemérés homogenizálás  dúsítás (inkubálás)  kioltás  inkubálás  azonosítási reakciók (szerológiai, biokémiai)  inkubálás  értékelés

33 Automatizálási módszerek
Hagyományos műveletek automatizálása Közvetlen mikroszkópos sejtszámlálás Folyadékáramlásos sejtszámlálás Mikroorganizmus bizonyos komponense: baktériumszám Mikroorganizmusok fiziológiai tulajdonsága alapján Antigén-ellenanyag kapcsolat detektálása Azonosítási reakciók

34 1. Hagyományos műveletek automatizálása
A) Rutin laboratóriumi műveletek gyorsítása 1. A minta homogénezésének új módszerei (ultrahang, rázólombik, Stomacher): 2. Az adagolás és a higítás automatizálása. 3. Az egyszer használatos eszközök alkalmazása (pipetták, Petri-csészék stb.). 4. A leoltási eljárások gyorsítása (anaerob tenyésztés adott gázösszetétel mellett, petrifilm eljárás). 5. A telepszámlálás egyszerűsítése (képanalizátor, lézeres számláló stb.). 6.Spirálmódszeren alapuló szélesztés Előny: előkészítési és telepszámlálási idő csökken Hátrány: inkubációs időt ténylegesen nem csökkenti

35 B) A direkt sejtszámlálás újabb módszerei
l. A jó vezetőképességgel rendelkező folyadékban egy kapillárison áthaladva az átmenő áramimpulzusok alapján. /tömeg szerinti osztályozás/ (PICOSCALE, LABORSCALE, FOSSOMATIC). 2. Sejtszámlálás hidrofób hálózatos membránszűrőn át. 3. Fluoreszcenciás és immunfluoreszcenciás mikroszkópiás eljárás, 4. Ultrahang echográfia

36 Fossomatik 5000 Sejtek kapillárison történő átvezetése
A kapilláris a mikroszkóp előtt helyezkedik el Az áthaladó sejtek foto-elektromos regisztrálása Citrometriás elven működő készülék Szomatikus sejtszám meghatározás nyers, vagy tartósított tejből

37 Membránszűrők keresztirányú szűrés fordított ozmózisos szűrés mikroszűrés ultraszűrés

38 Automata sejtszámláló berendezés

39 2. Direkt epifluorszcenciás szűrési technika (DEFT) -ÖCSI
COBRA, BACTOCOUNT (Direkt immunfluoreszcens technika - patogének) Cobra A vizsgálat menete: A vizsgált organizmusok összegyűjtése közvetlenül a calibrált szűrőn Megjelölés fluoreszcens anyaggal Leolvasás epifluoreszcens mikroszkóppal /vizsgálat folyamatos nyomon követése/

40 Élelmiszer/Mikro-biális anyag
3. Folyadékáramlásos fluoreszcenciás, vagy lézeres sejtszám meghatározás - ÖCSI, vagy speciális 4. ATP mennyisége = baktérium száraz tömegének 0,4%-a --> ÖCSI A vizsgálat elve: luciferin-luciferáz enzimrendszer hatására a mikrobák ATP-je fénykibocsátás mellett reagál. (relatív fénykibocsájtási érték-RLU) Reagens anyag (luciferin és luciferáz) Élelmiszer/Mikro-biális anyag fény

41 5. Ellenállás/ vezetőképesség mérése - ÖCSI, vagy speciális BACTOMETER, MALTHUS RABIT BAC-TRAC
A vizsgálat elve: a mikrobák szaporodása során bekövetkező ellenállás, vagy vezetőképesség változás mérésén és a mérési görhe elemzésén alapszik.

42 MALTHUS 2000 rendszer: élelmiszerekben lévő baktériumok és élesztőgombák minőségi és mennyiségi meghatározására alkalmas eljárás, amely teljesen automatizált és a konduktancia (vezetőképesség) mérésén alapul. Konduktancia-mérés görbéi

43 ChemScan RDI 90 perc alatt eredmény Érzékenység: 1 mikroorganizmus elegendő Nem szükséges sejt-multiplikáció Baktérium, spórások, penészek, élesztők Célzott azonosítási próbák Roncsolás mentes vizsgálat Közvetlen sejtszám meghat sejtig; hígítás nélkül

44 :                        Első lépés: membrán szűrés Szűrés 25 mm-es membránon. (Nagy mintamennyiség)                                        Második lépés: sejtek megjelölése Az egyes metabolitikusan aktív sejtek közvetlen fluoreszcens megjelölése Baktériumok, gombák spórások Kb. 90 perc Harmadik lépés: lézeres detektálás kb. 3 perc

45 Sejtjelölés folyamata
A citoplazmában:a nem fluoreszcens szubsztrát enzimesen bontódik Fluorochrome keletkezik Csak élő sejtek képesek bontani és megtartani a fluorochrome-ot  Élő és holt sejtek elkülönítése

46 D-Count ® Működési elve megegyezik ChemScan RDI-vel Különbség: nem szűrhető minták esetében alkalmazzák

47 6. Antigén-ellenanyag (immunreakciók) - speciális kimutatása
pl. patogén mikroorganizmusok (vírusok, baktériumok, stb.)

48 Immunológiai módszerek
ELISA, EIA Ensyme Linked Immunosorbent Assay, Ensime Immunoassay ELFA Enzyme Linked Fluorescent Assay RIA Radioimmunoassay FIA Fluorescent Immunoassay Latex agglutináció IMS Immuno Magnetic Separation

49 ELISA: (heterogén enzim-immun vizsgálat) Speciális mikroküvetták salmonella antigénekre előállított monoklonális ellenanyagokkal vannak töltve. A mintában lévő antigén és a kötött ellenanyag között immunkomplex alakul ki, melyhez egy enzimmel jelölt anti-salmonella konjugát kötődik (ellenanyag-antigén-ellenanyag szendvics komplex). Mosás + színképző szubsztrátot --> intenzív kék elszíneződés. Reakció leállítása speciális savas oldattal: kék szín sárgára változik. A keletkezett szín intenzitását 450 nm abszorbanciánál mérjük.

50 Mini VIDAS (ELFA) Eredmények: Elődúsítás, szelektív dúsítás
Vizsgálati minta és a hitelesítő (standard) minta fluoreszcencia értékeinek összehasonlítása --> RFV=Relative Fluorescence Value Összehasonlítás a küszöbértékkel: > v. = küszöbérték: + < küszöbérték: - Elődúsítás, szelektív dúsítás 1-1 cm3 15 min hőkezelés (100°C) 500 µl a mérőcsík első cellájába Vizsgálat: mosás, reakció az enzimmel fluoreszcencia mérés (4-metil-umbelliferil-foszfát)

51 A VIDAS immunanalizátor működési elve
A szubsztrát cirkulál az SPR-ben ki és be A pipettahegy (SPR) felülete specifikus monoklonális antitesttel bevont, s egyben pipettázó funkciót is ellát. Az SPR belső felületén specifikus monoklonális antitest van Meghatározandó mikroorganizmus Az 1. Cellába adagolt minta Egyéb mikroorganizmusok

52 Egymás utáni mosási folyamatok
Mosás utáni maradék Az antitest a mintában jelenlévő antigént megköti

53 Az 5. Cellában van az enzimmel jelzett konjugátum
Több mosási folyamat után a 2. poliklonális antitest hozzákötődik az előzőleg megkötött antigénekhez

54 Alkalikus-foszfatázzal konjugált antitest
„Szendvics” komplex Kromogén szubsztrátum (4-metil-umbelliferil-foszfát Befogott antigén Kötött antitest Egy „szendvics” komplex jön létre, amely az enzim kromogén szubsztrátjával egy fluoreszkáló vegyületet alkot, és ennek a fluoreszcenciáját méri a készülék 450 nm-en

55 7. Mikroorganizmusok identifikálása automatizált módszerrel:
ATB, VITEK - kolorimetria és/vagy nefelometria ATB Minden kittben 32 biokémiai vizsgálathoz szükséges szubsztátum van Inkubálás (4-24 h) Analízis: kolorimetriás, nefelometriás módszerrel mér. + reakciók alapján egy adatbázisból megmutatja, mely mikroorganizmusról van szó

56 VITEK A készülék tesztkártyája azonosító szubsztrátumokat tartalmaz dehidratált formában Tesztkártya beoltása a vizsgálati mintával és az inkubátor/olvasóba helyezése Az adatok óránként kerülnek kijelzésre

57 VITEK® 2 Baktériumok azonosítása Standardizált inokulumok segítségével Eljárás: Minta higítása az (érzékeny teszt) Kártyák feltöltése az inokulummal Inkubáció Leolvasás (140) Szoftveres kiértékelés Antibiotikum maradvány és fenotipus vizsgálat

58 RIA módszer (Radio Immuno Assay)
Radioaktív anyaggal jelzett antitest Antigén-antitest kapcsolat  radioaktivitás mérés (Jód 125-ös izotópja) Nagy érzékenység Egészségkárosító hatás. Drága módszer. Rövid felezési idő. Gyakoribb kalibrálás

59 FIA módszer (Fluorescent Immuno Assay)
Fluoreszkáló festékkel jelzett antitest Antigén-antitest kapcsolat  fluoreszcens mikroszkóp (UV fény)  sötét látótér Festék: pl.Fluoreszcin izotiocianát Érzékenység: 107 –108 /cm3 Magas költség Szubjektív leolvasás

60 IMS módszer (Immuno Magnetic Separation)
Elődúsítás és dúsítás műveletének gyorsítása Mikrobára specifikus antitest  ferromágneses gyöngyök felületén Gyöngyök hozzáadása az élelmiszermintához/szuszpenzióhoz Mikroba kötődik a gyöngyökön lévő antitestekhez (epitróp csop.) Gyöngyök mágnes segítségével az edény falához Mosás, majd tenyésztés táplevesben Meghatározás: ELISA, vagy ELFA módszerrel

61 Egyéb módszerek C) Sejtalkotók szelektív elemzése
Penészgombák kimutatása kémiai módszerekkel Limulus-teszt  G - mikrobák kimutatása DNS-hibridizációs technika D) Mikroba metabolizmus termékeinek kimutatása Reduktáz próbák (rezezurin-, metilénkék-, nitrátredukciós-próbák) Tejsav, borostyánkősav meghatározás  anyagcsere Kénhidrogén és ammónia kimutatás CO2 mennyiségi meghatározása  anyagcsere Mikrokalorimetria (anyagcsere  hő) Kis C atomszámú zsírsavak  gáz-, vagy folyadék-kromatográfiás meghatározása Latex-agglutináció: latex részecskék(antisavó) + szalmonella