III. rész DNS-RNS-fehérje prokariótákban

Az előadások a következő témára: "III. rész DNS-RNS-fehérje prokariótákban"— Előadás másolata:

1 III. rész DNS-RNS-fehérje prokariótákban

2 Tartalomjegyzék 1. Információ áramlás a sejtben 2. A genetikai kód
3. Prokarióta transzkripció 4. Prokarióta transzláció/fehérjeszintézis 5. Prokarióta génexpresszió szabályozása

3 1. Információáramlás a sejtben: DNS – RNS – fehérje
A gén a fehérje aminosavsorrendjét határozza meg A gén : a DNS-nek egy szakasza, amelynek bázissorendje meghatározza a fehérje aminosav- sorrendjét. AMINOSAVLÁNC GÉN …a fehérje aminosav- sorrendjét. A gén bázissorendje meghatározza…

4 A gén a fehérje aminosavsorrendjét határozza meg.
Kísérletes bizonyítékát annak, hogy a gén a fehérje aminosavsorrendjét határozza meg, Vernon Ingram, a Cambridge Egyetem kutatója szolgáltatta 1956-ban, amikor kimutatta, hogy a normál és a sarlósejtes vörösvértestek hemoglobinja között egyetlen aminosav különbség van. Vagyis a gén mutációja egyetlen aminosav cseréjét eredményezte (a normál glutaminsav helyett valin épült be a fehérjébe), ami bizonyítja, hogy a gén a fehérjék aminosavsorrendjét határozza meg. Normál hemoglobin aminosavsorrend Sarlósejtes hemoglobin aminosavsorrend

5 A DNS bázissorrendjétől a fehérje aminosavsorrendjéig két lépesben jutunk el: transzkripció és transzláció 1. A transzkripció/átírás során a DNS bázissorrendje alapján egy komplementer bázissorrendű mRNS molekula szintetizálódik, ami ugyanazt az (aminosavak sorrendjére vonatkozó) információt tartalmazza, mint a DNS. 2. A transzláció/fehérjeszintézis során az mRNS bázissorrendje alapján egy meghatározott aminosavsorrendű fehérje készül. A sejten belüli információ tehát a DNS – RNS – fehérje irányba áramlik. Ezt az elvet nevezte Francis Crick „centrális dogmának”. Prokarióta sejtben a transzkripció és transzláció egymáshoz kapcsoltan, egy helyen és egy időben játszódik le. Eukarióta sejtben a transzkripció a sejtmagban, a transzláció a citoplazmában elkülönülten játszódik le

6 2. A genetikai kód A genetikai kód megfejtésére irányuló kísérletek az 1960-as évek elején indultak, melyek eredményeként sikerült minden egyes kodon aminosav megfelelőjét meghatározni. Az első kodonokat Marshal Nirenberg határozta meg 1961-ben. A kísérlet célja: meghatározni, hogy az mRNS bázishármasai/tripletjei/kodonjai mely aminosavakat kódolnak. Mesterséges mRNS szálat szintetizált, amelynek minden nukleotidja uracil bázist tartalmazott. Ezt a poli-U RNS-t adta a kémcsőben lévő elegyhez. Bakteriális sejtmentes elegyet készített, amely minden, a fehérje szintézishez szükséges komponenst tartalmazott (riboszóma, tRNS, aminosavak stb.). Eredmény: Ebben a mesterséges rendszerben a csak uracilt tartalmazó RNS alapján csak fenilalaninból álló polipeptid szintetizálódott. Hasonló módon, a poli- AAA szintetikus nukleotid csak lizinből álló polipeptidet eredményezett , A poli-CCC esetében csak prolin aminosavak épültek be a polipeptid láncba. Következtetések: Az UUU kodon a fenilalanin aminosavat kódolja. Az AAA kodon a lizin aminosav kódja. A CCC kodon a prolin aminosavnak felel meg.

7 Az aminosavakat bázishármasok/tripletek kódolják.
DNA molecule Gene 1 Gene 2 Gene 3 DNS szál (templát) TRANSZKRIPCIÓ mRNA Fehérje TRANSZLÁCIÓ Aminosavak A C G T U Trp Phe Gly Ser Kodon 3 5 Transzkripció során egy adott gén esetében mindig csak az egyik szál (hogy melyik az génenként változik), az ún. templát vagy aktív szál íródik át a komplementer bázispárosodás szabálya szerint és határozza meg az mRNS bázissorrendjét . Az mRNS bázishármasait nevezzük kodonnak és mindig a szintézis irányában, 5’—3’ irányban írjuk őket. A transzláció során minden egyes kodon (kivéve a stop kodonokat) meghatároz egy aminosavat.

8 A genetikai kód – a kodonszótár
A kodonszótár az mRNS bázishármasait/kodonjait és az ezekhez rendelhető aminosavakat tartalmazza. A transzláció során minden egyes kodon (kivéve a stop kodonokat) meghatároz egy aminosavat. A STOP kodonok (UAA, UAG, UGA) a polipeptidlánc szintézisekor a szintézis végének helyét jelölik. Az AUG kodon a metionin kodonja, de ez jelzi a fehérje szintézisének START pontját is. Ha a kód alapján akarjuk kikeresni a megfelelő aminosavat, először a kód első betűjét a bal oszlopban, majd a második betűjét a legfelső vízszintes sorban, legvégül a harmadik betűjét a jobb oldali oszlopban keressük meg és a három betű átfedésénél találjuk a táblázatban a kodonnak megfelelő aminosavat. Pl GUU kódolja a valint.

9 A genetikai kód tulajdonságai
A kód degenerált, redundáns (degenerate or redundant), ami azt jelenti, hogy egy aminosavat több kodon is kódolhat. A glutaminnak két, a leucinnak pl. hat különböző kodonja van. Az azonos aminosavat kódoló bázishármasok első két bázisa általában azonos és a harmadik lehet különböző (a harmadik bázis ‘lötyöghet’/’wobble’). A kód egyértelmű (not ambiguous). Habár több kodon is kódolhat egy aminosavat, egy adott kódon viszont mindig csak egyféle aminosavat kódol, tehát a kód teljesen egyértelmű (not ambiguous). Pl : A CCU kodon csak a prolint kódolja. Ez igaz a prolin másik három kodonjára is, amelyek szintén csak prolint kódolhatnak. A metionin és a triptofán olyan aminosavak, melyek mindegyikének csak egy kodonja van. Miért lötyög/wobble a kód? A kodon antikodon kapcsolódás során (5’ — 3’ irányban) a kodon 3. és az antikodon 1. nukleotidja között nem komplementer bázispárosodás is létrejöhet. Az első két bázis stabil, a harmadik azonban lötyög. Ha például az antikodon 1. pozíciójában (wobble pozícióban) G van, a kodonban C-vel és U-val is bázispárt alkothat. A ‘wobble’ következménye, hogy a kód degenerált.

10 A genetikai kód tulajdonságai
A kodon vesszőmentes (szünetmentes). A kodon bázishármasai között nincs szünet, vagyis nem marad ki olyan bázis, amelyik nem tartozik az előtte vagy az utána következő triplethez. A kodon átfedésmentes. A kódon bázishármasai nem fednek át, ami azt jelenti, hogy nincsen olyan bázis, amelyik két egymás melletti triplet mindkettőjének tagja lenne. A genetikai kód általános érvényű (univerzális). A genetikai kód általános érvényű, vagyis néhány kivételtől eltekintve valamennyi fajban ugyanezek a kodonok, ugyanezeket az aminosavakat kódolják. A kódon vesszőmentes. Két kodon között nincs magányos nukleotid A kodon átfedésmentes. A 2. kodonba nem tartozhat az 1. kodonból nukleotid. A különböző leolvasási keretek, teljesen más aminosavakat eredményeznek. A leolvasási keret. Az mRNS bázishármasainak leolvasása a START kodonnal kezdődik, amely a metionin aminosavat kódolja. Ez a kodon határozza meg a leolvasási keretet is, vagyis azt, hogy az mRNS bázissorát milyen hármas csoportokban kell a fehérjeszintézis során leolvasni. Könnyű belátni, hogy ha nem a megfelelő keretben (hármas csoportokban) kezdődik a mRNS bázisok leolvasása, (nem a megfelelő három bázist olvassuk egy tripletnek) teljesen más kodonok, teljesen más aminosavakat fognak eredményezni.

11 3. Prokarióta transzkripció
A prokarióta transzkripció — melynek során a DNS-templát szálának bázissorrendje alapján egy komplementer bázissorrendű RNS molekula szintetizálódik — transzkripciós egységekről történik, amely egy promóterből, egy vagy több struktúrgénből és egy terminátorból áll. A struktúrgén az a DNS szakasz, amely egy polipeptidet kódol. Ezt nevezik cisztronnak is. Az RNS szintézis ún. transzkripciós egységekről történik. A transzkripciós egység egyik végén (5’) a promóter, a másik végén (3’) a terminátor helyezkedik el. A promóter és a terminátor között található egy vagy több struktúrgén. A struktúrgének olyan DNS-szakaszok, melyek fehérjéket/polipeptideket vagy RNS-t kódolnak. A struktúrgének a prokarióta genomban intron-mentesek és átírásuk eredményezi az elsődleges átiratot/primer transzkriptumot, amely megfelel az eukarióta érett RNS-nek. A kódoló struktúrgént cisztronnak is szokták nevezni. Az egy struktúrgént tartalmazó transzkripciós egységet monocisztronos transzkripciós egységnek is. Promóter struktúrgén terminátor DNS A terminátor szekvenciánál válik le az RNS és az RNS-polimeráz a DNS-ről. A promóterhez kötődik az RNS-polimeráz és kijelöli a transzkripció kezdetének, a startpontnak (+1) pontos helyét.

12 A transzkripciós egység lehet monocisztronos és policisztronos
Csak a prokariótákra jellemző a policisztronos transzkripciós egység. Ez azt jelenti, hogy egyetlen promóter alá rendelve több struktúrgén/cisztron is tartozik, melyek egy folyamatos mRNS-be íródnak át. Egy hosszú mRNS így több polipeptidet is kódol. Gyakran az egy anyagcsereúthoz tartozó enzimek génjei rendeződnek egy policisztronos transzkripciós egységbe és íródnak át egy policisztronos mRNS-be. A laktóz operon például egy ilyen (szabályozható, operátorral rendelkező) policisztronos transzkripciós egység, ahol a laktóz anyagcseréjéhez szükséges három enzim struktúrgénjei következnek egymás után és íródnak át egy mRNS-be. A monocisztronos transzkripciós egységben egy promóterhez csak egy gén kapcsolt, amely egy monocisztronos mRNS-be íródik át és egy polipeptidet eredményez. A policisztronos transzkripciós egységben egy promóterről íródik át több egymás után kapcsolt gén (A, B, C gének) egy policisztronos mRNS-re, amely alapján külön polipeptidek szintetizálódnak (A, B, C polipeptid) a fehérjeszintézis során.

13 Melyik DNS szál íródik át és hogyan nevezzük a szálakat?
A transzkripció során a kétszálú DNS-nek mindig csak az egyik száláról történik másolás. Ez a lánc szolgál az átíródás mintájául, ez a templát szál. A magyar középiskolás könyvekben a templát szálat nevezik aktív szálnak. Ebben a diasorozatban következetesen ezt a két elnevezést használjuk. A szakirodalomban, megegyezés alapján, a mintául szolgáló templát DNS szálat negatív/értelmetlen/antisense szálnak hívják. A másik szálat, melynek bázisszekvenciája megegyezik az RNS bázisszekvenciájával (kivéve, hogy Timin helyett Uracilt tartalmaz) pozitív/kódoló/sense szálnak nevezzük. Egy génszakasz bázisszekvenciájának leírásakor csak a pozitív/sense szál szekvenciáját adjuk meg balról jobbra 5’—3’ irányban (szintén megegyezés alapján). A genomban az egyes transzkripciós egységek esetében hol az egyik, hol a másik szál szolgál templátként. Mivel az RNS szál csak 5’—3’ irányban szintetizálódhat, az egyes transzkripciós egységek orientációja is más. Pozitív/kódoló/sense szálnak nevezi a szakirodalom azt a szálat, melynek bázisszekvenciája megegyezik az RNS bázisszekvenciájával. DNS Negatív/értelmetlen/antisense szálnak nevezik a szakirodalomban az átírás mintájául szolgáló templát szálat. Középiskolás könyvek ezt nevezik aktív szálnak. RNS

14 Prokarióta transzkripció és transzláció általános jellemzői
1. A baktériumoknak egyetlen típusú RNS-polimeráza van, amely az mRNS-en kívül a tRNS és rRNS gének átírását is végzik (eukariótákban három külön RNS-polimeráz van a három RNS típusra). A prokarióta RNS szintézis jellegzetessége, hogy a fehérjeszintézissel kapcsoltan zajlik. Az átíródó és egyre növekvő mRNS-ekhez már akkor rákapcsolódnak a riboszómák és megkezdődik a transzláció, mielőtt az mRNS-ek terminációja megtörténik. Az így kialakuló alakzat az ún. kromoszóma-poliszóma. 2. Az RNS-polimeráz közvetlenül kötődik a DNS promóter régiójához (szemben az eukarióta sejttel, ahol csak fehérje faktorok közvetítésével tud a promóterhez kapcsolódni).

15 A transzkripció folyamata három fázisra osztható:
iniciáció, elongáció, termináció Transzkripciós egység Az RNS-polimeráz folyamatosan választja szét a DNS két szálát és a templát DNS szál bázisainak megfelelő komplementer bázisú RNS nukleotidokat épít be a növekvő RNS láncba. A polimeráz elhaladása után a két DNS szál újra összekapcsolódik és leválasztja a képződő RNS szálat, amelynek nagy részét így a polimeráz húzza maga után. 1. INICIÁCIÓ/LÁNCKEZDÉS: Az RNS-polimeráz enzim a promóter régióhoz kapcsolódik, felnyitja a DNS két szálát és a szintézis kezdőpontjánál megkezdi a szintézist. 2. ELONGÁCIÓ/LÁNCNÖVEKEDÉS: A polimeráz halad a DNS szálon, felnyitja a DNS-t és a templát szál alapján 5’—3’ irányban szintetizálja az mRNS-t. Minél messzebbre kerül a polimeráz a kezdő helytől, annál hosszabb RNS szálat húz maga után. 3.TERMINÁCIÓ/LÁNCBEFEJEZÉS: Egy meghatározott terminátor szekvenciát elérve az mRNS/transzkriptum és a polimeráz leválik a DNS-ről és ezzel a folyamat befejeződik. Primer transzkriptum

16 szigma faktora (részletes)
A prokarióta promóter specifikus szekvenciáihoz kötődik az RNS-polimeráz szigma faktora (részletes) Az RNS-polimeráz feladatát tekintve (funkcionálisan) két fontos részből áll: A core polimeráz – katalizálja az RNS nukleotidok egymáshoz kapcsolását. A szigma faktor biztosítja az enzim specifikus kötődését a promóterhez és az átírás pontos kezdetének, a startpontnak (+1) a kijelölését. Core polimeráz Szigma faktor Upstream/megelőző Downstream/követő Az irányok megadásánál a fő viszonyítási pont az átírás kezdőpontjával megegyező nukleotid a startpont (+1). A startpont előtti szekvenciákat upstream/megelőző, a startpont utáni szekvenciákat downstream/követőnek nevezzük. A pozitív számok downstream növekednek.

17 A prokarióta promóter specifikus szekvenciáihoz kötődik az RNS-polimeráz (részletes)
Iniciáció/lánckezdés Első lépésben a szigma faktor a core/mag enzimhez (ami maga is 5 alegységből áll) kötődik. A szigma faktor (a core enzimhez kapcsolódva) két konkrét szekvenciát ismer fel a promóteren és ezekhez kötődik. Az egyik -35 a másik -10 bázisra van a szintézis kezdőpontját (+1) megelőzően/upstream. A -10 szekvencia egy AT gazdag régió, ahol a DNS két szála könnyen szét tud nyílni. A szigma faktor itt választja szét a DNS két szálát, ami hozzáférhetővé teszi a DNS aktív v. templát szálát a core enzim számára. A core enzim megkezdi az mRNS szintézist a kezdőponttól (+1). A szigma faktor a szintézis megkezdése után leválik az enzimről, és a lánchosszabítást már csak a core polimeráz végzi. Core RNS-polimeráz Szigma-faktor Az átírás kezdőpontja ennél az Adeninnél (+1) található. Az előző nukleotid a -1 (tehát 0 jelű nincs. A szigma faktor ide kötődik és itt választja szét a DNS-t.

18 Prokarióta promóter és RNS-polimeráz (egy kis ismétlés)
A prokarióta promóter és a polimeráz legfontosabb jellemzői (összefoglalás) A promóter tartalmazza azokat a szekvenciákat, amelyeket a polimeráz specifikusan felismer és hozzá tud kötődni. A promóter teszi lehetővé, hogy a polimeráz pontosan a kezdőpontnál (+1) kezdje meg a szintézist. A promóter szabja meg, hogy a két DNS szál közül melyiket használja templát/aktív szálként. A bakteriális RNS-polimeráz fontos jellemzője, hogy közvetlen kötődik a DNS-hez (szemben az eukarióta polimerázzal, amely csak fehérje faktorok közvetítésével tud a DNS-hez kötődni). A baktériumok egyetlen típusú RNS-polimerázzal rendelkeznek, amely az mRNS-en kívül a tRNS és az rRNS gének átírását is végzik (eukariótákban három külön RNS-polimeráz található a három RNS típusra).

19 A lánchosszabítást az RNS-polimeráz core része végzi a komplementer bázispárosodás elve alapján. (részletes) 1. Az RNS-polimeráz core része (miután a szigma faktor már levált róla) folyamatosan választja szét a DNS két szálát és a templát DNS szál bázisainak megfelelő komplementer bázisú RNS nukleotidokat épít be a növekvő mRNS láncba. 3. A polimeráz elhaladása után a két DNS szál újra összekapcsolódik és leszorítja a képződő RNS szálat, amelynek a nagy részét így az RNS-polimeráz húzza maga után. 2. A növekvő mRNS megközelítőleg 10 bázispárnyi szakaszon bázispárosodással kapcsolódik a templát DNS szálhoz.

20 A prokarióta terminátornál az mRNS leválik a DNS-ről és az RNS-polimerázról (részletes)
Termináció (láncbefejezés): A szintézis akkor fejeződik be, amikor az RNS-polimeráz eléri a terminátor szekvenciát. Az esetek egyik részében az ún. Rho-független terminátorban egy GC gazdag hajtűszerű hurok alakul ki az mRNS 3’ végén, amely leválasztja a transzkriptumot a templátról. Az esetek egy másik részében egy gyűrű alakú fehérje, az ún. Rho-faktor, az átíródott RNS-hez kötődik és az RNS-en ismeri fel a terminációs szekvenciát és itt választja le a polimerázt a DNS-ről. Mindkét terminációra jellemző, hogy az aktív jel, amely a terminációt előidézi az RNS-en jön létre. A terminátorról átíródott RNS-en jelenik meg az a szekvencia, amely hajtűszerű hurkot képez és az RNS-t leválasztja a DNS templát száláról. . A Rho-faktor az mRNS-en ismeri fel a terminációs szekvenciát, amihez odakötődik és leválasztja az mRNS-t a DNS-ről.

21 5’ nem kódoló UTR (untranslated) régió. Fehérje kódoló régió
A transzkripció végterméke az elsődleges átírat/primer transzkriptum (mRNS), melyen megkülönböztetjük az: 5’ nem kódoló UTR régiót, a fehérje kódoló régiót és a 3’ nem kódoló UTR régiót. Az 5’ UTR (untranslated region) régióban találjuk az ún. Shine–Dalgarno szekvenciát, amelyhez a riboszóma kis alegységének RNS-e kötődik a komplementer szekvenciáik alapján a fehérjeszintézis iniciációjában. 5’ nem kódoló UTR (untranslated) régió. Fehérje kódoló régió 3’ nem kódoló (untranslated) régió

22 RNS és DNS molekulák legfontosabb különbségei
Az RNS a DNS-hez hasonló polinukleotid, amely ugyanazt a genetikai információt hordozza. A két molekula között három lényeges különbség van. Az RNS általában egyszálú polinukleotid formában fordul elő. Gyakran képez viszont a szálon belül komplementer párokat, melyek valamilyen térszerkezetet alakítanak ki. Az RNS öt szénatomos cukor egysége a ribóz (nem dezoxiribóz, mint a DNS-ben). Három azonos bázis mellett az RNS a timin bázis helyett citozint tartalmaz.

23 4. Prokarióta transzláció/fehérjeszintézis
A transzláció az a folyamat, melynek során a sejt fehérjeszintetizáló apparátusa az aminosavakat peptidkötéssel egymáshoz kapcsolja az mRNS bázishármasai által meghatározott sorrendben. A folyamat legfontosabb résztvevői: Az aminosav aktiváló enzim feladata, hogy a helyes tRNS—aminosav párokat összehozza. Aminosav lánc aminosav tRNS A tRNS feladata, hogy az aminosavat a riboszómához szállítsa és leolvassa a kodont. A riboszómán kapcsolódnak össze a résztvevő molekulák.

24 A transzfer RNS (tRNS) közvetít az mRNS kodonja és az aminosav között
A tRNS, mint neve is mutatja, egy speciális, kb nukleotid hosszúságú RNS molekula, amely a láncon belül, a komplementer bázispárok között létrejövő hidrogénhíd kötések miatt jellegzetes „L” alakú térszerkezetet vesz fel, amely síkban kiterítve lóhere alakhoz hasonlítható. A molekulának két fontos funkciót ellátó részét különböztetjük meg. Az egyik, a molekula 3’ végén lévő, aminosav kötőhely, amely mindig CCA-val végződik és az utolsó nukleotidhoz (a cukor 3’ OH csoportjához) kapcsolódik az az aminosav (COOH csoportja), melyet a fehérjeszintézis helyére a riboszómához szállít. A másik fontos hely a molekula ellentétes pólusán az a három kiemelt bázis (bázishármas/triplet), melyek az ún. antikodont alkotják. A tRNS-ek az antikodont alkotó bázisokban különböznek egymástól. Az antikodon feladata, hogy a komplementer bázispárosodás alapján felismerje és hozzákötődjön a mRNS-nek ahhoz a kodonjához, amely azt az aminosavat határozza meg, amelyet a tRNS szállít (amely a tRNS-hez kapcsolt). Ha például az mRNS soron következő kodonja GCC, az azt jelenti, hogy a szintetizálódó polipeptid megfelelő pozíciójába alanint kell beépíteni. Az GCC kodont egy GGC antikodonnal rendelkező tRNS ismeri fel és kötődik hozzá. Ha ehhez a tRNS-hez az antikodonjának megfelelő alanint kapcsolta hozzá az enzim korábban, akkor a kodon – antikodon komplementaritás alapján a kodon által meghatározott alanin épül be a polipeptidbe. Az aminosav kötőhelyhez kapcsolódik az antikodonnak megfelelő aminosav. Az antikodon ismeri fel az mRNS-en az aminosav kodonját.

25 A riboszóma egy kis és nagy alegységből tevődik össze, melyek mindegyikét fehérje és riboszómális RNS alkotja Nagy és kis alegységek rRNS fehérje Összeszerelt riboszóma prokarióta eukarióta A riboszóma két alegységből áll: egy kis alegységből és egy nagy alegységből. A riboszómák fehérjéből és riboszómális RNS-ből állnak (rRNS). Az rRNS-eket is gének kódolják, tehát egy adott DNS szakaszról íródnak át. Eukariótákban ezek az rRNS-ek még a sejtmagban összekapcsolódnak a fehérje komponensekkel. A fehérjék a citoplazmában szintetizálódnak és innen kerülnek a sejtmagba. A kész riboszóma alegységek (kicsik és nagyok egyaránt) a sejtmag membránjának pórusain keresztül szállítódnak a fehérjeszintézis helyére a citoplazmába. A két alegyegység, mint azt látni fogjuk, csak azután kapcsolódik össze, miután a kis alegység már az mRNS-hez kötődött. Az eukarióta riboszóma alegységek egy kicsit nagyobbak, mint a bakteriális megfelelőik és molekulaszerkezetükben is különböznek, ami a baktériumok néhány antibiotikummal (tetraciklin, streptomicin) szembeni érzékenységének az alapja.

26 A riboszóma funkcióinak ellátásáért elsősorban a riboszómális RNS felelős.
A riboszóma szerkezete lehetővé teszi, hogy: a riboszóma egyidejűleg kapcsolódjon a mRNS-hez és a beérkező tRNS-ekhez, a tRNS antikodonja kapcsolódjon az mRNS kodonjához, a beérkező új aminosav peptidkötést alakítson ki a növekvő lánc karboxil csoportjával. Ennek megfelelően három helyet különböztetünk meg a riboszómán: P, A és E helyeket Újabb kutatások egyértelműen azt mutatják, hogy elsősorban a riboszómális RNS felelős a riboszóma feladatainak ellátásáért. A fehérje többnyire a riboszóma külsején helyezkedik el, míg a kis és nagy alegység találkozásánál, valamint az A és P helyeken főleg rRNS alkotja a riboszómát és így A tRNS-ek megkötése A mRNS-hez való kötődés A riboszómális alegységek kapcsolódása komplementer bázispárosododással történik. A peptidkötés kialakítását is az rRNS katalizálja mint riboszómális enzim avagy ribozim. A riboszómát ezek alapján egy nagy riboszómális enzimnek (ribozimnek) tekinthetjük. P hely, amelyhez a polipeptidet tartó tRNS kötődik. Az A hely, amelyez a következő új aminosavat szállító tRNS kötődik. A távozó tRNS az E (exit) helyen hagyja el a riboszómát.

27 A bázis-hármasok lefordítása aminosavakra két, egymást feltételező felismerési lépésben játszódik le. Első lépés: a helyes tRNS-aminosav pár létrehozása 1. Az aminosav aktiváló enzim aktív helye megköti az aminosavat és az ATP-t. A fehérje aminosavsorrendjét az mRNS egymás után következő bázishármasai kódolják. A bázishármasok lefordítása aminosavakra két, egymást feltételező felismerési lépésben játszódik le. Első lépés a helyes tRNS-aminosav pár létrehozása. Egy aminosavhoz azt a tRNS-t kell kapcsolni, amely megfelelő antikodonnal rendelkezik. (A megfelelő antikodon azt jelenti, hogy azzal az mRNS kodonnal komplementer, amelyik az adott aminosavat kódolja.) A helyes tRNS- aminosav párosítást az aminosav aktiváló enzim (pontos neve: aminoacil-tRNS szintetáz) végzi. Mind a húsz aminosavnak megvan a külön enzime, amelynek úgy van kialakítva az aktív helye, hogy csak az egymáshoz tartozó aminosav–tRNS párost ismeri fel és engedi, hogy az aktív helyéhez kötődjön. Egy aminosavhoz több tRNS (antikodonjában különböző) is rendelhető a kód ‘lötyögése’ miatt. Az aminosav aktiváló enzim az aminosavat egy nagyenergiájú kötéssel kapcsolja a neki megfelelő tRNS 3’OH csoportjához. 2. Az AMP az aminosavhoz kapcsolódik, miközben leválik róla egy pirofoszfát, amely rögtön hidrolizál. 3. A megfelelő tRNS belép az aktív helyre, kovalens kötéssel kapcsolódik az aminosavhoz, miközben az AMP felszabadul. 4. A tRNS a hozzákapcsolt aminosavval (aminoacil tRNS) leválik az enzimről és mehet a riboszómára.

28 A második felismerési lépésben a tRNS antikodonja a komplementer bázispárosodás alapján ismeri fel az mRNS kodonját. A második felismerési lépés: A tRNS antikodonja a komplementer bázispárosodás alapján ismeri fel az mRNS kodonját (bázishármasát, tripletjét). A tRNS tehát az antikodonjával komplementer kodont ismeri fel az mRNS-en. Annak, hogy ez korrekt kodon-aminosav kapcsolatot hozzon létre, az a feltétele, hogy az első lépésben a tRNS-hez a neki megfelelő aminosavat kapcsolja az aminosav aktiváló enzim. A két lépésben történő azonosítás logikája megegyezik a „ha A=B és B=C akkor A=C” logikájával. Itt is megjegyezhetjük, hogy a kodon első két bázisa stabil, a harmadik azonban gyakran ‘lötyög’. Ez pontosabban azt jelenti, hogy az antikodon-kodon kapcsolódás során (5’ — 3’ irányban) az mRNS 3. és az antikodon 1. nukleotidja között nem komplementer bázispárosodás is létrejöhet. Ha például az antikodon 1. pozíciójában (wobble pozícióban) G van, ez a kodonban C-vel és U-val is bázispárt alkothat. Az mRNS 3. és az antikodon 1. nukleotidja között nem komplementer bázispárosodás is létrejöhet. A kód ‘lötyög’. A kodon 1. és 2. bázisa stabil komplementer bázispárokat alkot az antikodon 2. és 3. bázisával. Sok esetben ez a két bázispár már egyértelműen meghatároz egy aminosavat.

29 Transzláció (fehérjeszintézis): a bázishármasok nyelvén írt genetikai kód lefordítása aminosav nyelvre Most, hogy megismerkedtünk a legfontosabb résztvevőkkel és azok feladataival, tekintsük át a fehérjeszintézis részleteit, ahogy az egy baktériumban (tehát prokarióta szervezetben) lejátszódik. A folyamat a transzkripcióhoz hasonlóan három lépésre osztható: Iniciáció Elongáció Termináció

30 A transzláció iniciációja során a riboszóma kis és nagy alegysége, valamint a formil-met-tRNS az mRNS-hez kötődik és létrehozzák az iniciációs komplexet. Iniciáció/lánckezdés A fehérjeszintézis első lépésében az mRNS, tRNS és a riboszóma két alegysége összekapcsolódik és egy ún. iniciációs komplexet alkot. Az iniciációs komplex kialakulásának lépései: Első lépés: a riboszóma kis alegysége kapcsolódik össze az mRNS-sel. A kettő közötti kapcsolatot az mRNS elején található szekvencia, (pontosabban az 5’ nem kódoló UTR, untranslated region) részének ún. Shine-Dalgarno szekvenciája) és a riboszóma kis alegységének rRNS-e közötti komplementer bázispárosodás teszi lehetővé. Második lépes: a formil-metionint hordozó tRNS (formil-metionin-tRNS) kapcsolódik a AUG start kodonhoz. 3. Harmadik lépés: a riboszóma nagy alegysége is ide kapcsolódik és ezzel létrejön az iniciációs komplex, melynek P helyét foglalja el a metion-tRNS. Az “A” hely kész a következő tRNS-t fogadni. Az iniciációs komplex: Riboszóma kis és nagy alegység mRNS tRNS + aminosav (a P helyen) A START kód lokalizálásában fontos szerepet játszik az mRNS és a riboszómális RNS közötti kölcsönhatás (komplementer bázispárosodás alapján).

31 A transzláció elongáció/láncnövekedés fázisában a kodon-antikodon komplementaritás alapján sorba állított aminosavak peptidkötéssel összekapcsolódnak. 1. Kodonfelismerés: A láncnövekedés első lépésében a következő aminosavat hordozó tRNS (aminoacil-tRNS) elfoglalja az ‘A’ helyet a komplenter antikodon-kodon kapcsolat alapján. A kodon felismerése energiát igényel, amit GTP hidrolíziséből felszabaduló energia fedez. Egy lánchosszabbodási ciklus kb. 1/10-ed másodpercig tart és minden ciklusban, mint láttuk, egy aminosavval növekszik a polipeptidlánc. 2. A peptidkötés kialakítása: Második lépésként az egymás mellé került két aminosav egy peptidkötéssel egymáshoz kapcsolódik. Amikor a ‘P’ helyen már egy hosszabb polipeptid van, a peptidkötés kialakításával az egész peptid átkerül a ‘P’ helyen található tRNS-ről az ‘A’ helyen található tRNS-re. 3. Transzlokáció/áthelyeződés. A harmadik lépésben a riboszóma egy bázishármasnyit elmozdul az mRNS 5’ vége felé (jobbra), így a polipeptidet tartó tRNS — amely az mRNS-hez rögzülve marad — az ‘A’ helyről átkerül a ‘P’ helyre. Eközben az üres tRNS az ‘E’ helyre kerül, ahonnan elhagyja a riboszómát. Az ‘A’ hely így újra megüresedik és kijelöli a következő kodont, melyet a következő aminosavat szállító tRNS ismer fel az antikodonjával. Az elmozdulás/transzlokáció energiaigényét egy újabb GTP hidrolízise fedezi és szükség van egy elongációs faktorra is (EF-G).

32 A peptidil transzferáz egy RNS enzim (ribozim)
Minden elongációs ciklusban a új aminosav NH2 csoportja és a láncvégi aminosav COOH csoportja között egy vízmolekula kilépésével peptidkötés alakul ki. A peptidkötés a karboxil- és az aminocsoportok között víz kilépésével (kondenzáció) jön létre. A peptidil transzferáz egy RNS enzim (ribozim) A formil-metionin karboxilcsoportja és a következő aminosav aminocsoportja között peptidkötés jön létre. A kondenzációs (vízkilépéssel járó) reakciót a nagy alegység riboszómális RNS komponense katalizálja, amely tehát ribozimként (enzim funkciójú RNS) működik.

33 Transzláció termináció/láncbefejezés fázisában a STOP kodonhoz érve a kész polipeptid leválik a tRNS-ről, amit a riboszómális alegységek követnek. Ez a tRNS aminosav-kötőhelyének utolsó nukleotidja (ribóz 3’OH). ...és egy vízmolekula hozzáadásával leválasztja a polipeptidet a tRNS-ről. A releasing faktor kapcsolódik a STOP kodonhoz… A releasing faktor ezt az észterkötést hidrolizálja és így az elkészült polipeptid (rózsaszín és kék aminosavak) leválik a tRNS-ről Termináció/láncbefejezés A lánchosszabbodás addig tart, amíg a riboszóma “A” helyére az mRNS STOP kodonja nem kerül. A STOP kodonok (UAG, UAA, UGA) az egész transzlációs folyamat végét jelzik. A következő tRNS helyett egy tRNS-hez hasonlító fehérjefaktor (releasing faktor) kapcsolódik a STOP kodonhoz. A releasing faktor a következő aminosav helyett egy vízmolekulát kapcsol a ‘P’ helyen lévő tRNS-hez kapcsolódó polipeptidlánc karboxil végéhez. A belépő vízmolekula felszakítja/hidrolizálja a polipeptid utolsó aminosava (COOH) és a transzfer RNS (ribóz 3’OH) közötti észterkötést. A kész polipeptid leválik a riboszómáról, majd a riboszóma is alegységeire esik szét.

34 A poliszómák nagyüzemesítik a fehérjeszintézist.
Poliszómák (poliriboszómák) Prokarióta és eukarióta sejtekre egyaránt jellemző, hogy egyszerre nem csak egy riboszóma kapcsolódik az mRNS-re, hanem több is, ami azt jelenti, hogy egy mRNS molekulán szimultán sok polipeptidlánc szintetizálódik. Minél távolabb jutott egy riboszóma az mRNS-en a kezdőponttól, annál hosszabb a tRNS-hez kapcsolódó polipeptidlánc.

35 5. Génexpresszió szabályozása prokariótákban
Konstitutív és szabályozott génexpresszió Az E. coli több ezer génjének egy része állandóan, konstitutív módon expresszálódik. Ezek a gének olyan enzimeket, vagy más fehérjéket kódolnak, melyekre a sejtnek folyamatosan szüksége van. Vannak azonban olyan gének, melyek expressziója szabályozott. Tehát nem folyik róluk állandó, konstitutív mRNS szintézis, ki és be lehet őket kapcsolni attól függően, hogy szüksége van-e a sejtnek az adott pillanatban a géntermékekre, van nincs. Így a sejt nem fektet be anyagot és energiát olyan termékek szintézisébe, amelyre az adott körülmények között nincs szüksége, valamint alkalmazkodni tud a változó környezeti feltételekhez. A baktériumok meglehetősen gyors alkalmazkodó képessége határozott szelekciós előnyt jelent számukra. Az E. coli baktériumban két alapvető szabályozási mechanizmusra találunk példát: Induktív és Represszív szabályozás

36 Génexpresszió szabályozása prokariótákban
Induktív szabályozás Az induktív szabályozás lehetővé teszi, hogy a sejt olyan enzimek termelését fokozza, indukálja (a gének aktiválásán keresztül), melyek egy újonnan megjelenő tápanyagforrás hasznosításához szükségesek. A laktóz operon jó példa az induktív génszabályozásra. A laktóz operon egy induktív operon. Az E. coli a glükóz lebontásához szükséges enzimeket konstitutív módon termeli, tehát amíg a táptalajban glükóz van jelen, addig ezt a szénforrást részesíti előnyben. Ha glükóz helyett csak laktóz (tejcukor) áll rendelkezésére, a laktóz megjelenése a sejtben olyan enzimek termelését váltja ki/indukálja, amelyek a laktóz lebontásához szükségesek. Ha a laktóz eltűnik a táptalajból, az enzimek termelése is megszűnik. A laktóz felvételéhez és kezdeti metabolizmusához (anyagcseréjéhez) három enzim szükséges: Béta galaktozidáz: a laktózt (diszacharid) egy galaktózra és egy glükózra vágja (hidrolizálja) Permeáz: egy transzport fehérje a baktérium sejtmembrájában, ami a laktózt szállítja a sejtbe. Transzacetiláz: acetilcsoportot kapcsol a laktózhoz (a jelentősége nem tisztázott). Amíg tehát laktóz nincs a táptalajban, ezeknek az enzimeknek a szintje nagyon alacsony a sejtben. A laktóz megjelenése azonban indukálja a három enzim termelését. Egy enzim vagy egy enzimcsoport szintézisének serkentését nevezzük enzimindukciónak. Nézzük meg, hogy milyen genetikai szabályozó mechanizmus áll a jelenség hátterében!

37 Az operon egy olyan szabályozható transzkripciós egység, amely az operátor régió és az operátorhoz kapcsolódó represszor fehérje segítségével szabályozni tudja a gének átírását és ezen keresztül az enzimek termelését. Milyen genetikai szabályozó mechanizmus tudja be- és kikapcsolni a laktóz anyagcseréjében résztvevő enzimek génjeit? A génexpresszió szabályozása nagyon hasonló transzkripciós egységek formájában valósul meg, mint a prokarióta gének működése általában. Ismételjük át, hogy mit tanultunk a transzkripciós egységek felépítéséről! A génexpresszió szabályozásának egyik szerkezeti és működési egysége az ún. operon. Az operon egy szabályozható (ki- és bekapcsolási lehetőséggel ellátott) transzkripciós egység. A szabályozás lehetőségét a promóter és a struktúrgének közé beékelődő szabályozó/regulátor elem (DNS szakasz), az operátor, és az ehhez specifikusan kötődni képes represszor fehérje teremti meg. A laktóz operon egy operátor és represszor fehérje által szabályozott policisztronos transzkripciós egység, melynek struktúrgénjei a laktóz metabolizmusához szükséges három enzimet kódolják. Az operátorhoz kapcsolódó represszor ad lehetőséget a szabályozásra azzal, hogy laktóz hiányában nem engedi a polimeráznak a gének átírását.

38 Laktóz operon a laktóz lebontásához szükséges enzimek génjeit tudja ki-be kapcsolni.
4. 2. 3. 1. 5. Tekintsük át részletesebben a laktóz operon felépítését és az egyes genetikai elemek funkcióját. 1. A három struktúrgén, amelyek a három enzimet kódolják, egymás mellett elhelyezkedve egy génsorozatot alkotnak, és egyetlen promoterről íródnak át egy policisztronos mRNS-be. A sejt három különálló enzimfehérjét tud az mRNS alapján szintetizálni, mert mindegyik génnek megvan a saját START és STOP kodonja, ami jelzi, hogy az egyes polipeptidek hol kezdődnek és hol végződnek. A riboszóma a fehérjeszintézis közben nem válik le az mRNS-ről. 2. A struktúrgének mellett (megelőző/upstream) helyezkedik el a promóter, amelyhez az RNS-polimeráz kötődik a már megismert módon. 3. A promóter és a struktúrgének közt találjuk az ún. operátor régiót. Az operátor biztosítja a szabályozás lehetőségét. Ha a represszor fehérje az operátorhoz kapcsolódik, megakadályozza, hogy a polimeráz átírja a struktúrgéneket. A struktúrgének, az operátor, és a promóter együttesét nevezzük operonnak. 4. A represszor fehérje génje, a regulátor gén, az operontól távolabb helyezkedik el. A regulátor génnek saját promótere van és konstitutív módon expresszálódik, tehát folyamatosan termeli a represszor fehérjét. 5. A represszor fehérjének két kötőhelye van. Az egyikkel a DNS-hez tud kötődni az operátor régiónál, míg a másikkal a laktóz molekulához kapcsolódik. Amikor a laktóz a represszor fehérjéhez kötődik, a represszor fehérjében olyan konformációváltozást idéz elő, ami megakadályozza az operátorhoz való kötődését. Most, hogy áttekintettük az operon egyes alkotóelemeit és feladatuk lényegét, nézzük meg, hogyan működik laktóz hiányában és laktóz jelenlétében az operon.

39 A laktóz operon laktóz hiányában kikapcsolja azokat a géneket melyek enzimtermékei pillanatnyilag feleslegesek. 3. Laktóz hiányában tehát a génekről nem íródik át mRNS, következésképpen nem szintetizálódik felesleges enzimfehérje sem. 1. Laktóz hiányában a regulátor gén által termelt represszor fehérje olyan térszerkezetű, amely lehetővé teszi, hogy az operátor régióhoz kötődjön. 2. A represszor fehérje fizikai akadályt jelent az RNS-polimeráz számára, amely így nem tud elmozdulni a struktúrgének felé és átírni azokat.

40 A laktóz operon laktóz jelenlétében bekapcsolja azokat a géneket, melyek enzimtermékeire szükség van a laktóz lebontásához. 3. A promóterhez kötődő RNS-polimeráz most már akadálytalanul át tudja írni az enzimeket kódoló 3 struktúrgént. 4. A három gén egy policisztronos mRNS-re íródik át. Az mRNS alapján szintetizálódik a három enzim. 1. Ha a sejtben megjelenik a laktóz (egy kevés laktóz szállító molekula nélkül is bejut a sejtbe), felismeri a kötőhelyét és a represszorhoz kötődik. 2. A laktóz kötődése a represszorhoz a represszor olyan konformációváltozását idézi elő, hogy a laktóz–represszor egység már nem tud az operátorhoz kötődni.

41 A triptofán operon lehetővé teszi, hogy a feleslegben jelenlévő triptofán a represszorhoz kötődve megakadályozza azoknak a géneknek az átírását — és így az enzimek termelését — melyek a triptofán saját szintézisében vesznek részt. 3. 3. 3. 2. 1. 4. Triptofán operon Az E. coli baktérium képes olyan táptalajon is nőni, amely nem tartalmaz szerves nitrogénforrást, pl. aminosavakat, ugyanis minden enzime megvan ahhoz, hogy az összes aminosavat szervetlen nitrogénforrásból (ammónium-klorid) szintetizálja. Ha azonban a táptalaj tartalmaz aminosavakat, az adott aminosav szintézisében résztvevő enzimek eltűnnek a baktérium sejtből. 1. Az adott aminosav gátolja/represszálja a saját szintézisében résztvevő enzimek termelését ill. az enzimeket termelő gének expresszióját. Ezt nevezzük génrepressziónak, amire jó példa a triptofán operon. A triptofán operon egy represszálható operon. A triptofán anyagcsere esetében a génműködés szabályozásának az a célja, hogy az alapállapotban működő operonról ne történjen mRNS szintézis akkor, ha az enzimek működésének végterméke (a triptofán) feleslegben van. A triptofán operon felépítése és működési elve teljesen megegyezik a laktóz operonéval, azzal a különbséggel, hogy a triptofán nagyobb koncentrációja a sejtben leállítja/represszálja a triptofán szintézisében résztvevő géneket. 2. A triptofán aminosav szintézise egy több lépésből álló anyagcsereút, melynek minden lépését egy enzim katalizálja. Az öt struktúrgén, mely az öt enzimfehérjét kódolja, egymás után helyezkedik el a DNS-en és egy promóter irányítása alatt egy policisztronos transzkripciós egységet alkotnak. 3. A strukturgének és a promóter között található az operátor. 4. A regulátor gén termeli a represszor fehérjét, ami alapállapotban nem tud az operátorhoz kapcsolódni. A represszor csak akkor képes az operátorhoz kapcsolódni, ha a triptofán molekula hozzákötődik. A triptofán ebben az esetben aktív részese a gének repressziójának, ezért korepresszorként működik. Ismét nézzük meg működés közben az operont!

42 A triptofán operon triptofán hiányában átírja azokat a géneket, melyek enzimei résztvesznek a triptofán szintézisében 3. A promóterről el tud indulni a polimeráz, át tudja írni a struktúrgéneket mRNS-re. 1. A regulátorgén kunstitutív módon termeli a represszor fehérjét. 4. Az enzimfehérjék, miután harmadlagos szerkezetüket kialakították, részt tudnak venni a triptofán bioszintézisében. 2. A represszor önmagában nem képes az operátorhoz kapcsolódni. …a sejt termeli a triptofánt, annyit amennyit fel is használ (tehát feleslegben nem halmozódik fel)

43 A triptofán operon triptofán feleslegben leállítja azoknak a géneknek az átírását, melyek enzimtermékei a triptofánt szintetizálják. 2. Az RNS-polimerázt az operátorhoz kötődött represszor megakadályozza abban, hogy a struktúrgéneket átírja. 1. A feleslegben lévő triptofán a represszorhoz kötődik és úgy változtatja meg annak térszerkezetét, hogy a represszor-tritofán egység az operátorhoz tud kötődni. 3. mRNS szintézis hiányában a fehérjeszintézis leáll és az enzimek szintje hamarosan lecsökken.