ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.

Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV."— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.
HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2 HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY (HIC)

3 TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Affinitási kromatográfiás tölteteknél spacer alkalmazásakor zavaró másodlagos kölcsönhatásokat figyelnek meg 1972  Shaltiel Hydrophobic Chromatography Spacer-ligandumként, agaróz hordozóra alkilaminokat alkalmaz Hjerten Hydrophobic Interaction Chromatography Porath Hydrophobic Salting-out Chromatography Kozmotróp sók adagolásával a fehérjék retenciója nő Hoftsee Hydrophobic Adsorption Chromatography A ligandum szénláncának növelése és sűrűségének csökkentése növeli az eljárás felbontóképességét Morris HIC (Trends Biochem Sci.) HPLC töltetek 5-10 m szemcseméret (analitikai) 20-40 m szemcseméret (preparatív), pórusméret növelése (300Å) Nem porózus töltetek (1-3 um) Perfúziós töltetek (200 és nm pórus)

4 HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC)
matrix spacer protein ligandum (domain)

5

6 HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC)
KÜLÖNBÖZŐ LIGANDUMOK HATÁSA A RETENCIÓRA (Gooding et al. 1984) OH-Propil → Propil → Benzil → i-Propil → Fenil → Pentil  a retenció növekedése 

7 KÜLÖNBÖZŐ ANIONOK ÉS KATIONOK HATÁSA A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSRA
PO43- ~ SO42- ~ CH3COO- ~ Cl- ~ Br- ~ NO3- ~ CIO4- ~ SCN- növekvő besózó - csökkenő kisózó hatás növekvő kaotrop - csökkenő kozmotrop hatás NH4+ ~ Rb+ ~ K+ ~ Na+ ~ Cs+ ~ Li+ ~ Mg2+ ~ Ca2+ ~ Ba2+ Phenyl-Superose, Pharmacia, Uppsala

8 SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT)
(NH4)2SO4 1,5 M HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT) ELVÁLASZTÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIÁVAL Fractogel EMD Propyl oszlop (10x1 cm, m) Eluens A – 20 mM Na-foszfát, pH : 7, ,1 M NH4-szulfát Eluens B - 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 Lineáris gradiens elúció Áramlási sebesség : 1 mL/perc Detektálás : 278 nm (Oláh, Kremmer, Boldizsár, J. Chromatogr. 2000)

9 REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
(NH4)2SO4

10 FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK PROTEIN RRT
HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK PROTEIN RRT Cytochrome C 0.59 Myoglobin 0.73 Ribonuclease A 0.76 Haemoglobin 0.91 Albumin (human) 0.94 Ovalbumin 1.00 Trypsinogen 1.02 Transferrin 1.07 Lysozyme 1.08 Albumin (bovine serum) 1.11 a-Chymotrypsinogen A 1.12 Pepsin 1.15 Trypsin inhibitor 1.23

11 Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins
Column A: Progel-TSK Butyl-NPR, 3.5cm x 4.6mm ID, 2.5μm particles Column B: Progel-TSK Phenyl-SPW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Column C: ProgeI-TSK Ether-5PW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Mobile Phase: A - 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 and 2.3 → 0M ammonium sulfate (12 min) B - C = 0,1M phosphate buffer, pH 7.0 and 1.8 → 0M ammonium sulfate (60 min) Flow rate: 1mL/min; Temp.: 250 C; Detection: UV 280 nm Samples: 1.  Myoglobin, 2. Ribonuclesae, 3. Lysozyme, 4. -Chymotrypsin, 5.   -Chymotrypsinogen

12  hidrofób kölcsönhatások
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA II. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA 1 - Kis sókoncentrációk - ionos kölcsönhatások - stabilizálás 2 - Nagy sókoncentrációk - speciális kölcsönhatások, kozmotróp sópárok, pl. (NH4)2SO4 - stabilizálás, majd kicsapódás,  hidrofób kölcsönhatások

13 HIC - TERVEZÉS

14 A HIDROFÓB KÜLCSÖNHATÁSÚ (HIC)
ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) ÖSSZEHASONLÍTÁSA Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Mindkét technika alkalmas a fehérjék elválasztására.

15 a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS A FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) KÜLÖNBSÉGEI - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező

16 I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN A fehérjék fiziológiás körülmények (pH, ionerősség) között harmadlagos ill. negyedleges szerkezettel (folded) rendelkeznek. A fehérjék apoláros karakterű aminosav összetevői (Ala, Val, Leu, Tyr, Trp, Phe) a szerkezet belsejébe törekszenek, egy részük azonban a felületre kényszerül (hydrophobic patch). Ez kb. a felület 40%-át képezi, és fontos funkcionális szerepe van a fehérje biológiai aktivitásában. Frank és Evans (1945) feltételezték, hogy vizes oldatokban a víz molekulái un. "icebergs" formában fedik a hidrofób felületeket. Némethy és Sheraga (1962) szerint két hidrofób anyag vizes oldatban létrejövő kapcsolata során a víz jégszerű struktúrája mintegy feloldódik és dezorganizálódik (entrópia nő – az energia felszabadulás fedezi az asszociáció energiaigényét) Vizes oldatokban ezek az erők stabilizálják a fehérjék natív szerkezetét. A fehérjék a vizes (fiziológiás) közegben általában jól oldódnak (stabilak) és nem törekszenek hidrofób kapcsolatokra.

17 III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA Melander és Horváth (1977) SZOLVOFÓB ELMÉLET - Az oldódás során az oldószer az oldandó anyagot befogadó üreget (cavity) képez. - Az oldhatóság a határfelületi szabadenergia megváltozásának a függvénye, ami az oldószer felületi feszültségétől függ. - Az oldat só koncentrációjának (m) növelésével az oldat felületi feszültsége arányosan változik: V = Vo + c . R . m R - a víz felületi feszültsége c - a só moláris felületi feszültség inkrementuma - c korrelációba hozható a sók (anionok) liotróp sorával (Hofmeister l888). - Az elmélet a hidrofób kromatográfiás gyakorlat számára legegyszerűbb formájában a retenció kifejezésére alkalmas össszefüggést (lnk - m) ad. A kapacitási faktor logaritmusa (lnk) a következő egyenlettel fejezhető ki : ln k = ln kviz + S. m az egyenes tengelymetszete (elvileg) a tiszta vízben mérhető kapacitási faktor logaritmusa. - A konkrét mérések az elmélet számos bizonytalanságára hívják fel a figyelmet.

18 PREFERENTIAL INTERACTION ELMÉLET
Timasheff (1959) Arakawa és Timasheff (1982) -  Egy egyensúlyi rendszerben lévő oldathoz adott komponens megváltoztatja a fennálló egyensúlyt. -  Az új komponens nem egyforma mértékben lép kölcsönhatásba a már ott lévő komponensekkel (preferentíal interaction), ezt fejezi ki a preferential interaction paraméter (PIP). -  Mérése a szabadentalpia vagyis a kémiai potenciál változásának mérésével lehetséges, ez arányos a felületi feszültség változással. -  Megállapították, hogy a kisózószerek (kozmotróp sók) a fehérjék környezetében negatív PIP értékkel bírnak, vagyis kizáródnak a fehérjék közeléből. Ennek eredménye egy többlet hidratáció, amely a fehérje kémiai potenciálját megnöveli végezetül kicsapódáshoz vezet. -  A só-fehérje kölcsönhatás két ellentétes hatás eredője: 1. kedvezőtlen felületi feszültség változás 2. kedvező só kötődés A kisózó szerek esetében az első hatás a domináns (egyértékű kationok sói), a besózó szerek esetében a második kompenzálja az elsőt.

19 A ligandum szerkezetének szerepe az albumin kötödésében a hidrofób kölcsönhatású kromatográfiában

20

21

22

23 AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY

24

25 AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA
ALAPELV Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibilis kölcsönhatásokat képeznek. Mátrix: - Poliszacharidok: agaróz                     (Sepharose, Superose) cellulóz - Organikus polimerek: poliakrilamid hidroxialkil metakrilát (Spheron) etilénglikol metakrilát (Fractogel) - kevert agaróz-poliakrilamid        (Ultrogel) - Silica, "porózus üveg"                (SelectiSphere)

26 AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK (IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES)
IMMUNOAFFINITY (immunosorption) LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides) HORMONES (receptors/carriers/antihormones) PROTEINS (enzymes, immunoglobulins) SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators) NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose) VÍRUS binding ligands PHENYL BORONATE binding (cis-diols) IMMOBILIZED METAL ION binding affinity DYE-LIGAND binding affinity - Cibacron Blue F3G-A - Malachit Green (A/T specific) - Phenol Red (G/C specific)

27

28 FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS
LECTINS FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS With N-linked sugars Lectin-AAA Lectin-DSA Lectin-GNA Lectin-MAA Lectin-SNA Lectin-PHA-L Specificity for structures L-Fuc(l-6)GIcNAcl Galβ(l-4)GlcNAc- Man (l-3)62 Man- SA (2-3)Gal SA (2-6)Gal Poly-Gal-GlcNAc- With O-linked sugars Lectin-ACA Lectin-PNA Lectin-ConA Lectin-RCA-120 Lectin-WGA SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr

29 Ready-to-use group specific adsorbents
AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Ready-to-use group specific adsorbents Product Specificity Applications Eluents Protein A-Sepharose CL-4B Fc region of IgG IgG (many species), IgG subclasses and fragments immuno complexes, antigens 1 M HAc, pH 3 0,1 M glycyltyrosine, pH 7 Con A-Sepharose -D-glucosyl, -D-mannosyl residues Glycoproteins, membrane proteins, glycolipids, polysaccharides Free sugar (methyl-  -D-glucoside); pulse or gradient (0-0.5 M). Decreased pH (not below 3) Borate buffer (0.1 M, pH 6.5) Lentil Lectin-Sepharose 4B Similar to Con A (weaker affinity) Membrane proteins, glycoproteins Free sugar (methyl-  -D-glucoside); pulse or gradient (0-0.1 M) Wheat germ Lectin-Sepharose 6MB N-acetyl-β-D-glucos-aminyl residues Glycoproteins, polysaccharides, cells (esp. T-lymphocytes) Free sugar (N-acetyl- β -D-glucos-amine); pulse or gradient. Helix pomatia Lectin-Sepharose 6MB N-acetyl-  -D galactos-aminyl residues cells (esp. T-lymphocytes), glycoproteins Free sugar (N-acetyl-  -D-galactosamine)

30 Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztítása
L. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon

31 FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA
DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY

32 DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS
FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A AFFINITY PACKING MATERIALS: (Capacities  10 mg albumin per ml gel) ~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) ~ Affi-GelR Blue Gel           (Bio-Rad) ~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5) CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm) ELUTION: Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer pH: 5.8 or 6.8 Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer pH:8.0 containing 2 M NaCl FLOW RATE: 1 ml / min SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25 Equivalent to 50 μL of original serum

33

34

35 DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF
HUMAN SERUM PROTEINS COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8 Human serum samples prepared by Sephadex G-25

36

37 FENIL BORONÁT AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

38 PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

39 PSEUDO-URIDINE DETERMINATION
PRINCIPLE NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC. SAMPLE PREPARATION MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8). ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8). ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL. HPLC ANALYSIS HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL., COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min. DETECTION: 254 nm.

40

41