Pull down assay és RNAi módszerek bemutatása Sirokmány Gábor.

Az előadások a következő témára: "Pull down assay és RNAi módszerek bemutatása Sirokmány Gábor."— Előadás másolata:

1 Pull down assay és RNAi módszerek bemutatása Sirokmány Gábor

2 Cdc42 és effektor kapcsolata

3 A pull down assay első kísérletes elemzése

4 A stimulus intenzitását és a létrejövő válasz kinetikáját is elemezhetjük.

5 Pertz, O. et al. J Cell Sci 2004;117:1313-1318 Design of different fluorescent probes for detection of Rho family GTPase activity in living cells

6 RNAi alapjai

7 Specificitás: Rac1 és Cdc42 szekvencia homológiája Target szekvencia megválasztásánál fontos szempont !

8 Ambion kit siRNS gyártás

9 p50RhoGAP GFP Transiently transfected HeLa cells „Saját gyártmányú” shRNAi vektor

10 Mellékhatások „Off-target”, nem szekvencia specifikus hatások: 1.Toll-like receptor 3 keresztüli hatások (IRF3-on keresztül) 2.PKR és 2’-5’ oligoadenilát-szintáz aktiválása és transzkripció inhibíció 3. Interferon képződéssel összefüggő válaszok ISG (interferon stimulált gének) expressziója ↑, pro-apoptotikus hatások 4. microRNA hatások a 3’ nem kódoló szakaszokon részleges szekvencia átfedéssel

11 Kontrollok (Publikációs minimum elvárások !!) 1. Ugyanazon mRNS-re targettált több különböző célszekvencia ad-e azonos hatást, fenotípust ? 2. Minimális nukleotidcserével eliminálható-e a hatás ? 3. Retranszfekció esetén kivédhető-e a hatás ? 4. Igen alacsony koncentrációk (~1 nM) elegendőek-e a hatáshoz ? (5. ún. scrambled siRNS, korábban ez volt az „alap kontroll”, ez ma már önmagában nem elégséges kontroll !!)

12 Kontrollok arzenálja Molecular and Cellular Biology, March 2006, p. 2160-2174, Vol. 26, No. 6 Takehiko Ueyama, Miklós Geiszt and Thomas L. Leto

13 Pull down assay és RNAi együtt a Rho GTP-ázok kutatásában

14 Ajánlott irodalom: 1. Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Jun;4(6):457-67. Review. 2. Benard V, Bohl BP, Bokoch GM Characterization of rac and cdc42 activation in chemoattractant-stimulated human neutrophils using a novel assay for active GTPases. J Biol Chem. 1999 May 7;274(19):13198-204.