Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet

Az előadások a következő témára: "Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet"— Előadás másolata:

1 Egészségkárosító kémiai hatások és megelőzésük Kromoszóma aberráció vizsgálat
Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE,

2 Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma
Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma * DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják * Hisztonok: bázikus fehérjék (argininben és lizinben gazdag) * 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és H4 nukleoszomális hisztonok Hisztonkorong (oktamer): 8 hisztonmolekulából álló (2*4) 2 csavarulatban 146 bázispárnyi DNS tekeredik rá 2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1 molekula

3 Kromoszóma morfológia
Eukromatikus régió: aktív géneket tartalmaz (génexpresszió, RNS szintézis) Heterokromatikus régió: inaktív DNS szakaszok konstitutív heterokromatin (pl. centromer) fakultatív heteroktromatikus régió rövid kar centroméra hosszú kar testvérkromatidák

4 Kromoszóma territórium egy adott kromoszóma a sejtmag
egy adott régiójában található Szigorú sejtmagi rend.

5 G-sávos normál női karyotípus
Fajok ecetmuslica rozs galamb egér patkány ember mezei nyúl kutya ponty páfrány Kromoszómaszám 8 14 16 40 42 46 48 78 104 1200 Humán lymphocyta kromoszóma preparátum Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ. Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység. Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó. Humán kromoszóma Gének 1 2 968 13 748 18 766 21 303 X 1184 (Barr test) Y 231 (mikrodeléció meddőség) Nemhez kötött öröklődés G-sávos normál női karyotípus

6 A sejtek kromoszómaszáma fajra jellemző, állandó érték.
A testi sejtekben a homológ kromoszómák nagyságuk szerint párokba rendezhetők. A testi sejtekben a kromoszómakészlet kétszeres, azaz diploid. Az ember testi sejtjei 46 kromoszómát tartalmaznak. Az ivarsejtek kromoszómaszáma a testi sejtekének a fele, a petesejt és a hím ivarsejt haploid. Az emberek ivarsejtjeiben 23 kromoszóma található. A nők sejtjeiben két homológ X kromoszóma található, a korai embrionális fejlődés elején a sejtek egyik X kromoszómája inaktiválódik (Barr-test).

7 Öregedés, rák, stabil kromoszóma
Telomer: - kromoszóma vége - rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár) genetikai óra, telomer rövidülés öregedés 2009 orvosi Nobel Díj - minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim működéséből adódóan - egészséges sejtekben a telomeraz inaktív és - Az emberi sejt 50 osztódásra képes. 50 osztódás után a sejt apoptózissal meghal. Tumoros sejtekben a telomer szerepe: a telomeráz enzim aktivitása magasabb Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű. Ivarsejtekben is!

8 MITOZIS * * * A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma számtartó osztódás.

9 MEIOZIS A meiozis a kromoszóma-számfelező redukciós osztódása, ivarsejt képződésének módja. Az S fázisban 4C-re duplázódó DNS tartalom két egymást követő osztódás során a DNS tartalom C-re redukálódik. A petesejt és a hím ivarsejt haploid. Az emberek ivarsejtjeiben 23 kromoszóma található, tehát fele a testi sejtekénél.

10 A mitózis és meiózis összehasonlító elemzése
                                                                                          

11 X-kromoszóma inaktiváció A nőstény emlősök sejtjeiben
az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon) . Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske. Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok). A nőstény emlősök teste mozaik, vagyis olyan sejtek klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív. Heterozigótákon detektálhatók lehetnek a foltok. Teknőctarka macska

12 Hemofilia A B Nemhez kötött recesszív megbetegedés VIII. faktor
IX. faktor A VIII. faktor Hemofilia Nemhez kötött recesszív megbetegedés

13 Vörös-zöld színtévesztés
Nemhez kötött recesszív megbetegedés Vörös-zöld színtévesztés Vörös-zöld színtévesztés Férfiak Nők

14 KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI:
Strukturális kromoszóma aberráció: deléció inszerció transzlokáció Numerikus kromoszóma aberráció: poliploidia aneuploidia

15 kromoszóma szegmentek elvesztése
Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza. A kis deléciók tolerálhatóak. A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.

16 Cri du chat – macskasírás szindróma
Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb deléciók is komoly abnormalitást okoznak. A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p) karjának vége hiányzik, és jár mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal. Szellemi visszamaradottság. 4 év alatti halál. születéskori gyakoriság: 1/50,000

17 Rákos sejtek gyakran mutatnak deléciókat

18 DUPLIKÁCIÓ: Kromoszóma szegmensek megkettőződése.
Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

19 Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

20 A gén duplikáció evolúciós szerepe
Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat. De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el. Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek. Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.

21 A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs változásoknak, a funkciók divergálásának
Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye. Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a működő hemoglobin molekulát. 3 h. korig az embrionális Hemg. Szülésig a magzati Hemg % Szülés után 2α 2ß.

22 Inverzió: Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának
az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.

23 intrakromoszómális transzlokáció: Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése
ugyanabba a kromoszómába. interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák közötti transzlokáció. Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés. A gének pozíciója azonban megváltozik.

24 Down szindróma: 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát. 21-es kromoszóma triszómia Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés. Születéskori gyakorisága nagy: 1/500-1/700

25 Myeloid leukémia A 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma” Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

26 Burkitt’s lymphoma Az esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye. Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.

27 Alternatív toxikológiai
in vitro vizsgálatok Ajánlott teszt rendszerek: Egysejtűeken végzett tesztek Rovartesztek in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek in vivo mutagenitási tesztek long term karcinogenitási állatkísérletek humán epidemiológiai vizsgálatok Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata előnyei: in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) rövid idejű olcsóbb reprodukálható nem használ élő állatot Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat egybehangzó eredményére van szükség.

28 Mutagén kémiai anyagok
Hatás mechanizmus Interkaláló vegyületek daunomicin proflavin itidium bromid akridin orange planáris aromás gyűrűk DNS bázispárok síkjával párhuzamosan beékelődnek Alkilező vegyületek mono-, bi-, polifunkciós alkilezőszerek alkil szulfonátok nitrozó vegyületek diazo vegyületek bázisokba metil etil alkil gyököket építenek be kovalens kötés a két DNS szál között Krm törés , krm mutáció teratogének és karcinogének Salétromsav Na-, K-nitritek (pH 3,3) salétromsav keletkezik bázisokat deamilálja bázispár tanziciót okoz C-U A-HyX (tranzició) G-X (inaktiváció) krm. törés, deléció, inszerció N-nitrozo vegyületek dietil-nitrozamin N-metil-N-nitrozó-guanidin szteptozotocin, cikazin a sejt anyagcserével a vegyületek mutagénné karcinogénné alakulnak szabadgyököt képző vegyületek hidrogén-peroxid hidroxil amin hidrazinok aldehidek fenolok hidroxi-, hidroperoxid –primidinek keletkeznek pont mutáció, lánc szakadás citozin hidroxiláció Nehézfémek Co, Ni, Cr, Zn, Mn, Hg pl: Hg: purinpázisokhoz kapcsolódik Mn: polimerázok aktivitását befolyásolja DNS szintézis inhibitorok N-hidroxilurea,etoxikoffein,tetrametil-hugysav DNS replikációt leállítják

29 Környezeti mutagén anyagok
élelmiszeradalékok: nitritek, nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2 femnilén-diamin diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek:citosztatikumok, altató és nyugtató szer antiallergiás gyógyszerek Meclizin fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2) növényvédőszerek, herbicidek, insekticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid akrilaldehid propán szulfon dimetil szulfát dietil szulfát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán etilén klorid vinil klorid Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

30 Azonos szakmai szabályok
GLP= Good Laboratory Practice (Helyes Laboratóriumi Gyakorlat) ISO= International Organization for Standardization (Nemzetkozi Szabványugyi Szervezet) Vizsgálati irányelvek OECD= Organisation for Economical Cooperation and Development (Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet) Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint Célja: azon anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma aberrációt okoznak emlős sejtekben.

31 A kromoszóma aberráció vizsgálat Sejtek
Alkalmazható sejtvonalak jellemzői: stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita) jó növekedési képesség, rövid generációs idő, kariotípus stabilitás, állandó krom. szám. Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása. kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957) Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12). Sejtvonalak ellenőrzése: Kariogram Kromoszóma szám Mycoplazma Spontán kromoszóma aberráció gyakoriság Történeti kontroll

32 Vizsgálati anyag előkészítése:
kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás oldószer kiválasztása hígítási sor készítése stabilitás vizsgálat archiválás Elő-kísérlet: citotoxicitási vizsgálat MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim) mitotikus index meghatározása MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya. A populáció proliferációjának a mértékét jellemzi. Koncentráció Legkevesebb három elemezhető koncentráció. Citotoxikus anyag esetén: va. a festék-redukciót 50%-kal csökkenti. Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M

33 Metabolikus aktiválás:
Direkt-és indirekt-mutagén anyagok Metabolikus aktiválás: S9 alkalmazása rákcsálók enziminducerrel (Aroclor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) kofaktorokkal kiegészítve (ADPH, glukóz-6-foszfát). S9 végkoncentráció 1-10% közötti. citokróm P450 enzim aktiválása. Indirekt mutagének kimutatására alkalmas

34 Kontrollok: Kezelési idők:
Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C Metabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirén Oldószer. tápfolyadék Archiválás Kezelési idők: 4 óra +S9 4 óra -S9 KIÉRTÉKELÉS Negatív pozitív 24 óra -S9 ismétlés 48 óra -S9

35 Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése
Kolhicinezés: Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában. Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár %-uk is blokkolt metafázisban található. A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

36 Kromoszóma preparálás
Fénymikroszkópos értékelés kromatid típusú aberrációk: kromoszóma típusú aberrációk: deléció deléció exchange exchange

37 CHO sejt, kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2010.

38 CHO sejt, Deléció. Felvétel OKBI. MSBO. 2000.

39 CHO sejt. Deléció. Felvétel: OKBI. MSBO 2000.

40 Humán limfocita. Kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.

41 B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS
(SISTER CHROMATID EXCHANGE , SCE) VIZSGÁLAT OECD TG 479 A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés. DNS csere a kromoszóma két testvérkromatidája között, reciprok DNS csere. Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük. Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés. Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5). Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még nem okoz krom. aberrációt. Alkalmazása primer prevencióban.

42 Bloom syndroma Örökletes betegség.
Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma törékenység. Jelentős mutagén túlérzékenység. normál sejt Bloom syndromás beteg sejt

43 A KROMOSZÓMA INSTABILITÁST JELLEMZI
Bloom szindróma A KROMOSZÓMA INSTABILITÁST JELLEMZI a/ a kromoszóma törések nagy száma b/ a testvér kromatida kicserélődések nagy gyakorisága c/ a magasabb daganatképződési kockázat d/ DNS reparációs hibák

44 B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS) in vitro vizsgálata emlős májsejteken
OECD TG 482 Primer hepatocita sejtkultúra. Felvétel: OKBI. MSBO

45