CELLULÁRIS SZÍV-ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK Dr. Virág László

Intracelluláris mikroelektród technika Voltage clamp technika Patch clamp technika

Intracelluláris mikroelektród technika

Ag/AgCl 3 M KCl Re ~ 10 - 40 MOhm 0.1 - 0.2 m

erősítő számítógép ingerlő A/D d e r Detektált jel P szervfürdő d: ingerlő elektróda e: mikroelektróda r: referens elektróda P: preparátum számítógép A/D ingerlő erősítő Detektált jel P d e r 100 ms 50 mV 0mV

20 mV 100 ms 50% APA Vmax 90% RP APD50 APD90 előinkubáció anyag kimosás 60 perc 20-60 perc 60 perc

Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál parancsjel (voltage command) holding potenciál “makroszkópikus” nátrium-áram

A voltage clamp áramkör felépítése

Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete

Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (1) Szívjunk be egy kis membrán darabot a mikropipetta hegyének belsejébe (átmérő ~ 1 µm) Sejt

Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (2) “Gigaohm-seal” R > 1 GOhm Sejt

Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt

Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. zárt nyitott + + Sejt

Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. zárt zárt nyitott Sejt

Nátrium csatornák tulajdonságai parancsjel (voltage command) 10 msec

Nátrium csatornák tulajdonságai A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak

Nátrium csatornák tulajdonságai A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. “makroszkópikus” nátrium áram

Nátrium csatornák tulajdonságai A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik “makroszkópikus” nátrium áram

Nátrium csatornák tulajdonságai A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 300 felvétel szummája “makroszkópikus” nátrium áram

Nátrium csatornák tulajdonságai A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz A csatornák inaktivációja miatt a másodszori nyitás nagyon ritka 300 felvétel szummája “makroszkópikus” nátrium áram

Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987) A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus áramhoz viszonyítva. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz A csatornák többször is kinyílhatnak, ha nincs inaktiváció Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987)

Patch clamp technika konfigurációi On-Cell Cell-Attached

Patch clamp technika konfigurációi Inside-out patch On-Cell

Patch clamp technika konfigurációi On-Cell Whole Cell

Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell

Patch clamp technika konfigurációi outside-out patch Whole Cell

Whole cell konfiguráció Rs Cm Rc

Run-down jelenség ATP-függő kálium áram

Run-down jelenség L típusú kalcium áram

Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell, perforated patch Whole Cell - amphotericin-B - nystatin

Run-down jelenség L típusú kalcium áram

Sejtizoláció - Ca2+ - mentes perfúzió - emésztés (kollagenáz...) - mechanikai agitáció

L típusú kalcium áram

L típusú kalcium áram

L típusú kalcium áram

L típusú kalcium áram

L típusú kalcium áram

L típusú kalcium áram

L típusú kalcium áram

Áram-feszültség (I-V) karakterisztika L típusú kalcium áram Áram-feszültség (I-V) karakterisztika anyag 5-10 perc 3-5 perc 10-15 perc kimosás előinkubáció