Haemopoetikus sejt alapú haematologiai immuntherapia Prof. Dr. Udvardy Miklós tanszékvezető egyetemi tanár, Belgyógyászati Intézet igazgatója DEOEC Belgyógyászati Intézet II. sz. Belgyógyászati Klinika Hematológiai Tanszék, Debrecen

Onko-haematologia aranykorszak Célzott therapia: monoklonális antitestek, jelátvitel gátlók (pl. imatinib), ATRA, proteaszóma gátlás sok kórkép megoldás felé halad Vannak nehéz helyzetek, pl. időskori AML, indolens lymphomák ahol nincs áttörés Sejtes vaccinatio ekkor indokolt, a részleges remissio (nem a nagy tumortömeg) mellett

ŐSSEJTEK…. Embryonális blastocysta totipotens 2. Embryonalis csira sejt pluripotens 3. Köldökzsinór 4. Felnőtt őssejt multipotens (5. Embryonális cc. őssejt)

Haemopoetikus őssejt Multipotens szomatikus őssejt, tipusai: 1. CD133+, CD34-: pluripotensebb, long-term HSC (haemopoesis, máj?, izom?, angiogenesis?, neuron?) 2.CD34+, CD133+: HSC és haemangioblast 3. CD34+, CD133-, zöm, short term HSC Adheziv fehérjék (VLA -4-5) Cytokin receptorok (c-kit, flt-3)

Haemopetikus őssejttel végzett immun therapia Allogen transplantatio utáni és graft versus host és graft versus tumor effektus Redukált, mini-, mikro- allotransplantatio nem myeloablativ, hanem jelentős immun effektus (pl. időskori AML) Donor lymphocyta infusio (CML, AML), további immnmodulatio (pl. Kepivance)

Aktiv immunizáció Releváns betegség (egyéb th. nem jelent megoldást) Legalább részleges remissio állapotában alkalmazható Hagyományos antigen ellenanyag képzés az onkohaematologiában limitált hatékonyságu Sejtes alapu vakcina (pl. dendritikus sejt) a jelen és jövő utja

Immunisatiós lehetőségek A beteg tumor sejtjeinek extractuma pontatlan, részben túlhaladott, de mégis jó lehet (colorectalis, myeloma) Több betegtől származó keverék, kultura Idiotypus (myeloma, lymphoma) fehérje, körülményes izolálás Molecular rescue, Peptid lymphomában a hibás gén szekvencia klónozása, amplifikációja vagy géntechnika (pl. tobamovirus nicotinia) Más antigen, pl. CEA, 10 kD colon tumor

Beviteli utak Monocyta eredetű dendritikus sejt döntően cellularis, erőteljes válasz másodlagos humoralis válasz változatos válasz arány (immun és klinikai) Adjuváns (kulcslyuk csiga hemocianin, KLH) döntően humorális, jó válasz arány lymphomában is „Naked DNA” injectio nem elég a tapasztalat Tumor-DC fusiós technika (myeloma, kisérletes) Géntechnologia-géntherapia (AML) DC + KLH (Id alapu, NHL, myeloma)

Dendritikus sejt Folliculáris dendritikus sejt nyirokcsomó – integritas vakcinációs célra invaziv Monocyta (CD14) eredetü dendritikus sejt in vitro cytokin hatás Bőr, Langerhans sejtek Lymphoid prekurzor eredetü

A dendritikus sejtes vakcináció alapjai Dendritikus sejt felveszi a tumor antigent Intracellularis fázis Antigen felszini expressio, döntően MHC II presentatio A gazdaszervezetbe visszajuttatva főként CD4, de további helper/suppressor sejt aktiválás, majd humoralis válasz is T sejt proliferatio, cytokin válasz, antigen specifikus tumor lysis B sejt válasz

Monocyta eredetü dendritikus sejt („Cologne model”) Teljes vér (60-80 ml) vagy Apheresis, CD14 selectio (adherentia, poz. selectio) dendritikus sejtté alakitás In vitro cytokin inkubáció (GM-CSF, IL-4) + tumor antigen/peptid CD14 -, nincs T és B sejt marker MHC I, II (CD1+, 81+) Aktiváció: LPS, TNF, CD40-ligand Immunsuppressio, tolerancia is kiváltható inkubáció flt-3 (ligand) Legalább 2-8 M sejt, iv. (is) beadható

Keyhole limpet, kulcslyuk csiga Immunstimultor és adjuváns „B Immunostimulator” (AIDS), NHL tanulmányok (1993) Döntően cellularis, de CD4 és 8 is Idegen fehérje, mellékhatások DC és KLH (myeloma, foll. NHL) KLH – kulcslyukcsiga hemocyanin, kb. 1000 kD nagy fehérje

Lymphoma vakcinációs tanulmányok, folliculáris NHL Első Stanford-tanulmány: 41 beteg, CVP utáni remissio, Id-KLH vaccinatio 14 immunválasz alakult ki, a responderek tulélése 12 évvel a diagnózis után100%, több molekuláris remissio, főleg CR-ben adott vakcina esetén Bendandi tanulmány: 20 beteg, kemoth. utáni remissio, Id-GM-CSF vakcina cellularis válasz 2/3-ban, humoralis felében a 11 responderből 8 bcl-2 negativ lett Naked DNA Fázis III tanulmány (USA, multicentrikus), eredmények inkább előzetesek Timmermann tanulmány, 35 folliculáris lymphoma 35 Id-DC folliculáris lymphoma (Stanford) kemotherapia után (első CR) első 10: 8 immunválasz 4 klinikai regressio további 25 Id-DC+KLH booster injectio regressio (Id DC) 22%, progressio hiánya (Id DC+KLH) 70% (43 hónap %), részben molekuláris remissio jó eredmények a CR idején végzett vakcináció

Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination Pre-vaccine 11 months post-vaccine

Freedom From Progression Follicular Lymphoma first remission (Timmermann tanulmány) 20 40 60 80 100 2 4 6 8 10 PROBABILITY (%) TIME (YEARS) Responders (n=14) non-Responders (n=18) p<0.0001

DC vakcináció, myeloma Eisen, állatkisérlet, izolált Id ellenes T (CD4) sejt, regressio Id-ellenes humoralis immunválasz th. értéke kicsi, keringő PP-re hat Döntően Id-DC, ujabban KLH kombinációval Id-DC alapu hatékonyságot is korlátozza a jelentős paraproteinaemia Mégis cytolysatum?? Uj tanulmányok: peptid alapu vakcináció, ill. Id alapu DC+KLH, van válasz (30-40%) Autolog BMT után 3 hónappal (Stanford)

Id izolálás Paraproteinaemia legalább 0,4 g/l Izotípus és (al)osztály analízis Eltérő M, A, G-1, G-2, G-4, G-3 Affinitas chromatographia, kicsapás 95% tisztaság Alkalmas DC és KLH vakcina készitésre A hatás limitje - paraproteinaemia

Figyelemreméltó kazuisztika Maliander V et al. Leukemia, 1:165, 2004 Egyetlen AML-es beteg esete, akinek WT-1 elleni vakcinával – monotherapiaként -komplett remissioja alakul ki

Wilms tumor antigen (1), WT-1 Wilms tumorral összefüggésben ismerték fel először Zinc-finger transzkripciós faktor, sejt növekedés és proliferáció szabályozása, telomerease funkciók AML, ALL, CLL, számos nem- Hodgkin lymphoma

WT-1 RT-PCR és haematologia AML-ben rossz prognosztikai jel, de ez vitatott MDS-ben diagnosztikus lehet CML-ben ugyancsak jellemző, a szint csökkenése jól jelzi a tirozinkináz gátló kezelés várható hatékonyságát Jó MRD marker Tumor antigen peptidszekvenciák, HLA asszociációkkal

Gvax WT-1, fázis I-II tanulmány WT-1 peptid, a beteg saját in vitro irradiált tumor sejtjéval 54 AML eset, parciális remissioban 70%-ban esett a WT1 szint Az igy válaszolók 2 éves tulélése jelentősen javult Lényegesebb szövődmény, mellékhatás nem volt

February 2007 | 26 ! Peptide immunotherapy with a validated target: WT1 ! AML known to be immune responsive ! Activity already demonstrated with analogous products • 66% immune response; 57% durable clinical response in AML ! Short development path with indication of AML patients in first CR • 12 month PFS endpoint ! Off the shelf approach addressing most immune haplotypes • Four synthetic and natural peptides for CD8 and CD4 response ! Inexpensive to produce

Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Information provided: Vaccine Therapy and GM-CSF in Treating Patients With Acute Myeloid Leukemia, Myelodysplastic Syndromes, Non-Small Cell Lung Cancer, or Mesothelioma This study is currently recruiting patients. Sponsored by: Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Information provided: National Cancer Institute (NCI) ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00398138

Condition Intervention Phase Leukemia Lung Cancer Malignant Mesothelioma Peritoneal Cavity Cancer Drug: WT-1 analog peptide vaccine Drug: incomplete Freund's adjuvant Drug: sargramostim Procedure: biological therapy Procedure: diagnostic test Procedure: flow cytometry Procedure: immunoenzyme techniques Procedure: non-specific immune-modulator therapy Procedure: non-tumor cell derivative vaccine Procedure: polymerase chain reaction Procedure: vaccine therapy Phase 1

. 1 47 F Breast cancer Surgery, chemotherapy Weekly 12 SD 2 63 M Breast cancer Surgery, chemotherapy Weekly 12 SD 2 63 M Glioblastoma Surgery, radiotherapy, chemotherapy, INF-ß 3 68 Malignant fibrous histiocytoma None PD 4 33 Surgery, radiotherapy PR 5 45 Surgery, chemotherapy, radiotherapy, INF-ß 6 21 Primary neuroectodermal tumor Surgery, chemotherapy, radiotherapy 7 29 8 69 Surgery, radiotherapy, INF-ß 9 52 Rectal cancer 10 48 Surgery, chemotherapy, hormonal-therapy .

Saját eddigi WT-1 eredményeink Peptid keverék vagy módositott peptidek előállitása indul mRNS mérés beállitása vérből és csontvelői mintákból (WT-1 splice varánsok mérésére is alkalmas), az erőteljes expresszióval járó esetek azonositására (Biró Sándor, Human Genetika), RT-PCR (Taqman, G6PDH) Mérések AML, MDS, CML-ben, ill. nyitás a lymphoma vonalra

A GAPDH gén expressziója egészséges (1, 2, 3)és AML betegben (4, 5, 6) Rn=normalizált fluoreszcencia szignál 6 5 3 2 4 1

6 A WT1 gén expressziója egészséges (1, 2, 3,) és AML betegben (4, 5, 6) Rn=normalizált fluoreszcencia szignál 5 4 3 2 1

DEOEC program Klinikai Sejttherapiás központ colorectális cc DC sejtes- CEA, Fázis I., melanoma, haematologia HAEMATOLOGIA -auto PBSCT 100 eset,, allogen 2007 II. félév? - AML, adjuváns, DC alapu WT-1, 65 év feletti esetek - haemangioblast-angiogenesis program, Fázis I, ETT 5 eset - myocardium, fázis I. ETT, 8 eset

Dendritikus sejtek Antigen presentatio, aktivált állapot