durvafelszínű-Endoplazmatikus Retikulum dER Proteinek szintézise és válogatása Dr. habil. KŐHIDAI László egyetemi docens Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet 2014. október 2.

Endoplamatikus = sejten belüli; retikulum = hálózat kiterjedt membrán-rendszer a sejt membránjának kb. 50%-át teszi ki csöves + lemezes = ciszternák a sejtmagmembrán külső lemezének folytatása két típus: durva felszínű ER (riboszómák) sima felszínű ER

rER

s-ER (sima felszínű ER) szerkezet: csöves funkció: szintézis: phospholipidek, cholesterin, ceramid szintézis: szteroidok Ca2+ tárolása és szabályozás méregtelenítés – cyt P450

A dER felszínéhez kapcsolódó riboszómák pancreas exocrin sejtjében (TEM) Palade, G.E. 1974

mRNS peptid poliriboszóma

Riboszóma – mRNS – Poliriboszóma

A riboszóma molekuláris felépítése 60S rRNS + peptidek rRNS

Riboszóma alegységek (prokaryota)

Prokaryota és eukaryota riboszómák összehasonlítása (1)

Prokaryota és eukaryota riboszómák összehasonlítása (2)

A riboszóma valódi szerkezete ? A riboszóma valódi szerkezete

t-RNS aminosav aktiváló enzim riboszóma antikodon kodon

A tRNS identitását meghatározó elemek

Iniciáció

Elongáció

Khorana, H.G. Nirenberg, M.W. 1968

A peptid kötés kialakítása peptide bond peptidyl transferase

Termináció

Peptidek internalizálódása a dER-be

Szekréciós proteinek szintézise a dER-en

Az SFR (SRP) szerkezete általános 300 bázisnyi RNS 6 protein P54 - szignál peptid P9, P14 – riboszóma kötés P68, P72 – peptid mozgatása

Szekréciós proteinek szintézise a dER-en

A transzlocon-csatorna elektron mikroszkópos képe

Riboszóma-translocon-ER membrán kapcsolódása

Translocon komplex TRAM – (= translocating chain-associated membrane protein) köti a szignál szekvenciát Sec61p – a translocon csatorna fő összetevője; a gyűrű-alakú struktúra felépítője Sec 61 b és Sec 61g kötődik a Sec 61p-hez és így alakul ki a Sec 61 komplex A Sec 61 komplex kötődik a riboszómához, részt vesz a transzmembrane transzferben

A GDP/GTP ciklus és a GTP hidrolízise – A szerkretorikus protein kapcsolódása a transloconhoz

A dER-en szintetizálódó, integrans membránproteinek elhelyezkedése a membránban

Az inzulin receptor szintézise és inzerciója az ER membránba N-terminus az ER lumen felé C-terminus a citoszól felé A szignál szekvencia levágódik Stop-transzfer membrán-kihorgonyzó szignál

Asialoglikoprotein receptor szntézise és inzerciója az ER membránba C-terminus ER lumen felé N-terminus a citoszól felé Nincs N-terminális ER szignál szekvencia az el nem távolított integral szignál membrán kihorgonyzóként működik

A több transzmembrán, a-helikális szegmenttel rendelkező proteinek szintézise és inzerciója - El nem távolított szignál membrán kihorgonyzóként működik - Stop-transzfer membránkihorgonyzó szekvenciák El nem távolított szignál membrán kihorgonyzóként működik stb.

Poszt-transzlációs modifikációk Proteolítikus bontás Glikoziláció Aciláció Metiláció Foszforiláció Szulfatálás Preniláció C-vitamin függő modifikációk K-vitamin függő modifikációk Szelenoproteinek

Proteolítikus bontás Szignál peptid eltávolítása preproproteinek preproteinek Szignál peptidáz

A célbajuttató szignálszekvenciák jellemzői Cél organellum Jellegzetes hely a proteinen Szignál eltávolítás A szignál jellege dER N-terminal + 6-12 főként hidrofób aminosav, gyakran egy vagy több bázikus aminosav követi Mitochondrium 3-5 nem egymásutánni Arg vagy Lys reziduum, gyakran Ser és Thr; sohasem Glu vagy Asp Színtest Nincs általános motívuma, gyakran gazdag Ser,Thr-ban, kevés Glu és Asp Peroxisoma C-terminal - Ser-Lys-Leu Nucleus Internal 5 bázisos aminosav clustere vagy két rövidebb cluster melyet 10 aminosav választ el

Glikoproteinek Jellegzetes cukrok: glukóz, galaktóz, mannóz, fukóz, GalNAc, GlcNAc, NANA O-glikozidos kötés – Ser, Thr hidroxil csoportjai, hidr-Lys N-glickozidos kötés – konszenzus szekvencia N-X-S(T) (DE nem P) Major N-kötött csoportok: magas mannóz tartalmú típus, hibrid típus, komplex típus (szialsav)

Glikoziláció dER N-kötődés a GlcNAc-hoz dER O-kötődés a GalNAc-hoz

O-kötött cukrok: Cukrok kötve - UDP, GDP (mannose), CMP (NANA) glycosprotein glycosylttransferase N-kötött cukrok: Egy lipid összekötőt (dolichol phosphate) feltételez

N-Glikoziláció

Glikozilfoszfatidil inozitol (GPI) –által kihorgonyzott peptidek A GPI-kihorgonyzott peptidek a felszíni membrán külső oldalára kerülnek

Protein hajtogatódás (folding): Protein Disulphide Isomerase (PDI) A nem megfelelően kialakított diszulfid kötések felbontása Segít elérni a legstabilabb szerkezetet

Protein folding: Bip Bip = binding protein = Hsc70 a Hsp-70 család tagja (chaperonok) az ER lumenében található reverzibilisen kötődik a transloconhoz Szerepe: - elősegíti a helyes szerkezet kialakulását a naszcens peptidben (Bip-ATP Bip-ADP) - szükséges a translocon-on való átjutáshoz - megelőzi a prteinek aggregálódását és a helytelen hajtogatódást - segít lezárni a translocon pórusát

Protein folding: Peptidyl-prolyl isomerase: a peptidyl-prolyl kötések körüli elfordulást segíti elő Oligosaccharide protein transferase: szénhidrát láncokat juttat az új peptidre amint azok belépnek az ER lumenébe Calnexin, calreticulin: a glikoproteinek CHO csoportjaival lép kapcsolatba

Protein szignálok: Az ER és a Golgi integráns, szolubilis proteinjeinek helyben tartását a KDEL-receptorok segítik elő. Ezek felismerik a KDEL szignált (Lys-Asp-Glu-Leu - C-terminus). ER membrán proteinek - KKXX (dilysin motívum) a C-terminuson. Egyéb ER membrán proteineken di-arginin motívum van az N-terminuson.

Chase-pulse technika

Antibiotikumok A protein szintézis különböző lépéseit gátolják Actinomycin D - transzkripció (komplex DNS-sel) Rifamycin - transzkripció (RNS polymerase) Amanitin - transzkripció (RNS polymerase II) Streptomycin - iniciáció Tetracycline - aminoacyl-tRNS - A lókusz Erythromycin - tRNA transzlokációja az A-ról a P lókuszra Cycloheximide - “ (csak eukaryotákban) Chloramphenicol - peptid kötés Puromycin - termináció Penicillins és Cephalosporinok - a bakt. sejtfal szintézise (proteoglycan-ok)

A P A A actinomycin rifamycin amanitin streptomycin chloramphenicol tetracyclin chloramphenicol A puromycin A P erythromycin, cycloheximide