Golgi komplex, fehérjék szortírozása és a vezikuláris transzport

Az előadások a következő témára: "Golgi komplex, fehérjék szortírozása és a vezikuláris transzport"— Előadás másolata:

1 Golgi komplex, fehérjék szortírozása és a vezikuláris transzport
Láng Orsolya Semmelweis Egyetem, Genetika, Sejt- és Immunbiológiai intézet FOK 2017 gsi.semmelweis.hu

2 Fehérjék sorsa összefoglalás

3 Fehérjék sorsa összefoglalás

4 A célbajuttató szignálszekvenciák jellemzői
ismétlés A célbajuttató szignálszekvenciák jellemzői Cél organellum Helye a proteinen Szignál eltávolítás A szignál jellege dER N-terminal + 6-12 főként hidrofób aminosav, gyakran egy vagy több bázikus aminosav követi Mitochondrium 3-5 nem egymásutánni Arg vagy Lys reziduum, gyakran Ser és Thr; sohasem Glu vagy Asp Színtest Nincs általános motívuma, gyakran gazdag Ser,Thr-ban, kevés Glu és Asp Peroxisoma C-terminal - Ser-Lys-Leu Nucleus Internal 5 bázisos aminosav clustere vagy két rövidebb cluster melyet 10 aminosav választ el

5 Vázlat Golgi apparatus Fehérjék módosulásai Szekréciós mechanizmusok
Vezikuláris transport elemei

6 Camillo Golgi (1843-1926) Nobel díj 1906
"internal reticular apparatus"

7 Golgi kimutatása I. Fénymikroszkóppal Fluorescens mikroszkóp
Aoyama - ezüst impregnáció immuncitokémia Részleteket lásd a gyakorlaton

8 Elektronmikroszkóppal
Ultravékony preparátum Fagyasztva törés

9 Golgi ultrastruktúrája
zsákok (sacculus) csövek vezikulumok

10 cisz Golgi network (CGN)
DER cisz Golgi network (CGN) anterográd cisz Golgi retrográd mediális Golgi transz Golgi transz Golgi Network (TGN) Sejtmembrán

11 Elektron tomográfia

12 A Golgi és a sejtváz viszonya
DNS Mikrotubulus hálózat Golgi

13 A Golgi elhelyezkedése
Függ: - a sejt funkciójától-típusától (pancreas sejt apikális oldal) - polarizáltságától (migráló sejt- lamellopodium irányában) - sejtciklus fázisaival változik DNS Golgi Mikrotubulus hálózat

14

15 Fő funkciói válogatás transzformáció (átalakítás) membránba-csomagolás
transzport válogatás transzformáció (átalakítás) membránba-csomagolás

16 Vezikuláris transport a cistrenák között Ciszternális érés
cisz Golgi network (CGN) cisz Golgi mediális Golgi transz Golgi transz Golgi Network (TGN) Sejtmembrán

17 Újra több adat támasztja alá a ciszternális sodródás jelenségét

18 cisz Golgi network (CGN)
DER cisz Golgi network (CGN) Mannóz foszforiláció anterográd Mannóz eltávolítás cisz Golgi retrográd Mannóz eltávolítás mediális Golgi GlcNAc hozzáadása Galaktóz hozzáadás transz Golgi Sziálsav hozzáadása szortírozás Transz Golgi Network (TGN) Sejtmembrán

19 CGN a peptidek az ER-ből vezikulumokban érkeznek
az érkező peptidek N-glikoziláltak nem történt válogatásuk az ER-ben A proteinek kétirányú transzportja: az ER szolubilis, endogén proteinjei transzport vezikulumokban recirkulálnak - retenciós szignál szükséges (KDEL) lizoszómális enzimek válogatása és transzportja

20 A lizoszómális enzimek válogatódása és modifikációja
Mannóz-6-foszfát (M-6-P) szignál: a lizoszómális hidrolázok felismerésén alapul az ú.n. “signal patches” (szignál foltok – az aminosavak megfelelő 3D kombinációja) megkívánt fő enzime: GlcNAc-foszfotranszferáz Mannózok foszforilációja: elősegíti ezen enzimek osztályozását/válogatását további módosítástól véd

21 Az M-6-P jelölés

22 N- és O-glikoziláció

23 Glikoziláció a Golgi-ban
Az N-glikozilációs mintázat módosítása cisz-Golgi: mannóz - típusú oligoszaccharidok komplex oligoszaccharidok TGN: sziálsavval történő kapcsolás – negatívan töltött O-glikoziláció: főként a mediális- és a transz-Golgi-ban zajlik a Ser és Thr oldalláncai glikozilálódnak

24 cisz- Golgi mediális- Golgi mediális- Golgi mediális- Golgi TGN
transz- Golgi © 2000 by Geoffrey M. Cooper

25 Glikoziláció jelentősége
Hajtogatódás – 3D konformáció proteázokkal szembeni védelem hidrofil karakter sejt adhézió (CAM-ok) antigenitás (A,B,O vércsoport antigének) transzport szignál (lizoszómális enzimek-M6P) external coat (glikokalix)

26 Egyéb módosulások glükóz-amino-glikán (GAG) láncok
szulfatálás (proteoglikánok, peptidek Tyr rez.-ai) - TGN proteolítikus módosítás – szekréciós vezikulum

27 Proteoglikánok: nagyméretű, negatívan töltött, O-glikozilált és szulfatált fehérjék

28 Lipidek szintézise- módosítása a Golgi-ban
ceramid glikolipidek szfingomyelin EC

29 Specifikus Golgi kimutatás
MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Sejtek) epitél sejtek DNA (Hoechst) Golgi (ceramide) Lysosomes (LysoTracker) Molecular Probes, Inc.

30 compartmentjeinek enzim tartalma
A Golgi különböző compartmentjeinek enzim tartalma acid phosphatase trans Golgi network osmium reduction cis-Golgi Savas foszfatáz TGN Ozmium redukció Cisz Golgi festetlen

31 Transzport utak a TGN-ből
transz Golgi Lizo-szóma TGN szekréció Érés, módosítás exocitózis Konstitútív IC Regulált Sejtmembrán EC inzulin

32 A TGN-ből induló fő transzport útvonalak
1, endoszomális-lizoszomális compartment transzport vezikulumok - M-6-P receptorok 2, felszíni membrán - szekréció konstitutív szekréció – a felszíni membrán és az ECM lipid és peptid komponenseinek transzportja 3, exocitózis regulált szekréció

33 A szekréciós vezikulumok módosulásai
szelektív aggregáció - TGN további modifikáció és válogatás inaktív előanyagok - aktív enzim vagy hormon (pl. preproinzulin (DER)- proinzulin (Golgi)- inzulin) koncentrálás - vízvesztés hidratálás – pl. proteoglikánok egyes citoplazmatikus anyagok felvétele pl. hisztamin

34 Konstitutív szekréció
Pl: szérum fehérjék (máj sejtek) ECM fehérjéi, membránfehérjék Regulált szekréció Pl: hormonok, emésztő enzimek

35 A szállított molekulák koncentrálása
membrán leválás révén Figure 13-65a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

36 Az exocitózis fő lépései
Figure 13-66a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

37 A szekréció utolsó lépése az exocitózis (inzulin)

38 Alternatív útvonalak egyes molekulák, melyek nem a rER-en szintetizálódnak (pl. interleukin 1a és 1b - IL1a-IL1b, bázikus fibroblaszt növekedési faktor-bFGF) ezeket az ú.n. ABC-transzporterek szállítják (ATP-binding casette) az alternatív útvonal egyéb szerepe: - mérgező proteinek eltávolítása - a citoszól protein koncentrációjának szabályozása

39 Alternatív szekréció - fehérjék
Pl. IL-1 beta (pro-inflammatórikus citokin) Pro-IL-1beta inflammaszoma Molekulári interakció indukálja a felszabadulást a megfelelő szignál következtében

40 Alternatív - vezikula Klasszikus szekréció
Pl. alpha-synuclein szekréciója Klasszikus szekréció 2) Recirkuláló korai endoszóma 3) Exoszoma (multivezikuláris test (MVB))

41 Különböző szekréciós mechanizmusok előfordulhatnak egy adott sejttípusnál is (pl. IL-1β)
A gyulladásos szignál erősségétől függő mechanizmusok.

42 Hibák a válogató mechanizmusban
lizoszómális enzimek nem kerülnek bele az endoszómába DE az enzimek belekerülnek a constitutív szekréciós útvonalba és kiürülnek I (=inclusion) = zárványsejt betegség: - GlcNAc-fozfotranszferáz defektusa - az enzimeken nincs M-6-P szignál - a lizoszómális enzimek “kiszabadulnak” a sejtből - a sejten belüli emésztés károsodik - a nem-emésztett anyagok ZÁRVÁNY-TESTEKET alkotnak

43 Vezikuláris transport

44 James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof
2013 James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof

45 https://www. nobelprize

46 Intracelluláris vezikuláris transzport
Kommunikáció – sejten belül; sejt-környezet Belső membránrendszer Anyagok felvétele és emésztés helyére (lizoszómák) szállítása - endocitózis Proteinek szállítása az ER-Golgi útvonalon a felszíni membránhoz - exocitózis

47 Vezikuláris transzport fő útvonalai a sejtben
Endocitózis Szekréció MVB= multivezikuláris test

48 Intracelluláris vezikuláris transzport
Endoplazmás reticulum A kétirányú, kompartmentek közti transzport egyensúlyban van Ezt a membránproteinek folyamatos visszaáramlása biztosítja A bioszintetikus-szekréciós és az endocitotikus útvonalak 10 vagy több kompartment között teremtenek kapcsolatot Golgi Késői endoszóma Szekréciós vezikulum Bioszintetikus-szekréciós útvonal Lizoszóma Endocitotikus útvonal Korai endoszóma Helyreállító-fenntartó útvonalak Extracelluláris tér

49 Transzport vezikulum A membránnal határolt vezikulumok meghatározott anyagokat szállítanak Szekréció Lizoszómális enzimek Membrán és ECM összetevői A szállítás irányát a membrán összetevői határozzák meg ld. donor és target compartmentek

50 Vezikuláris transzport molekuláris alapjai I.
Fehérjék kiválogatása a donor sejtalkotóban szignál (a fehérjén) receptor (a donor membrán belső felszínén) 2. Vezikulum képződés és lefűződése szignál a receptoron burok a citoplazmatikus felszínen speciális foszfolipid összetétel mechanoenzim 3. A vezikulum szállítása diffúzió, citoszkeleton 4. Célmembrán megtalálása komplemeter v és tSNARE-k a vezikulumok citoszol felöli felszínén

51 Vezikuláris transzport molekuláris alapjai II.
5. A vezikulumok kihorgonyzása és dokkolása a célmembránon monomer G fehérjék (Rab) és SNARE-ek közreműködésével 6. A vezikulum és a célmembrán fúziója SNARE-ek és fúziós fehérjék 7. SNARE-ek szétválasztása NSF segítségével

52 Burkos vezikulumok A burok szerepe:
Egyes membrán-komponenseket (pl. receptorok) meghatározott membrán-foltokba (patch) koncentrál A burokkal fedett felszín lefűződésének elősegítése – vezikulum képzés

53 Burkos vezikulumok típusai
Clathrin-burkos vezikulum COPI-burkos vezikulum COPII-burkos vezikulum Mindegyik típusra eltérő transzport jellemző

54 A három burkos vezikulum morfológiailag is megkülönböztethető

55 Clathrin-burkos vezikulum:
Golgi – plazmamembrán transzportok COPI- és COPII-burkos vezikulumok: dER - Golgi közti transzportok

56 Klatrin szerkezete és a klatrin burkos vezikulum

57 A clathrin-burok kialakulásában résztvevő
protein-protein és protein-lipid kapcsolatok

58 Összefoglalás: Clathrin-burkos vesiculum
AP: Adaptor protein Beta- arrestin Klatrin Dynamin

59 Vezikuláris transzport: dER - Golgi

60 Anterográd Figure 13-24b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

61 dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (1)
Aktiválódás Szállítandó molekula bekötődése Sar1 – monomer G-fehérje

62 Előre haladó transzport – COPII (2)
dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (2) Burok összeszerelése –vezikulum kialakulása Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

63 dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (3) Vezikulum lefűződése
Heterotetramer Heterodimer Figure 13-13d Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

64 Összefoglalás: COPII-burkos vezikulum

65 Retrográd Figure 13-24b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

66 Golgi- dER: Retrográd transzport – COPI
Feltétel: retenciós szignál (KDEL) KDEL receptor COPI COPI triád: Arf1 - pink; gamma-COP - light green; beta-COP, dark green; zeta-COP - yellow; delta-COP - orange; betaprime-COP - light blue; alpha-COP - dark blue Figure 13-24a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

67 Összefoglalás: COPI-burkos vezikulum
ARF1

68 Vezikuláris transzort: A citoplazma egyéb részei

69 A vezikulum célba juttatás fő lépései
SNARE – soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor v – vezikula t - target Transz-SNARE komplex Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

70 A célbajuttató rendszer regenerálása
NSF – N-ethylmaleimide sensitive factor Adaptor fehérjékkel köt a membránhoz és széttekeri a SNARE-ket Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

71 A vezikulumok fúziójának lépései
hemifúzió csőképződés fúzió Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

72 Homotipikus fúzió NSF – N-ethylmaleimide sensitive factor
Adaptor fehérjékkel köt a membránhoz és széttekeri a SNARE-ket Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

73 A transzport egyéb fontos elemei:
G proteinek pl. Rab fehérjék Foszfoinozitidek Fúziót meghatározó egyéb fehérjék pl. adaptorok Lefűződést elősegítő molekulák Folytatás a jövő héten

74 Figure 13-72a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)