Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia Protein kémia 1923 F. Pregl : Mikroanalitika 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1952 Stein and Moore : Aminosav analizis 1932 Bergman és Zervas : Benziloxi-karbonil csoport Kromatográfia 1954 P. Edman : Protein szekvenálás Elektroforézis B. Merrifield : Szilárd fázisú peptid szintézis F. Sanger : Az inzulin priemr szerkezete Röntgen (X-ray) krisztallográfia Á. Furka : Kombinatorkus peptid szintézis NMR M.F. Perutz és J. C. Kendrew A myoglobin térszerkezete Tömeg spektroszkópia

A peptid kötés: amid kötés (E.Fischer, 1902) amid poliamid Emil Fischer John B. Fenn

A peptid kötés: amid kötés (E.Fischer, 1902) N-terminális C-terminális Dipeptid: 2 Oligopeptid : 2-15 Polypeptid: >15

Kötéstípusok a fehérjékben Kovalens Amid - CO – NH - Diszulfid - S – S - Nem kovalens Hidrofób, Van der Waals H-híd (inter és intra) ionos

Fehérjék szerkezetének meghatározása Tisztítás – homogén minta előállítása Aminosavsorrend (primer szerkezet) meghatározása - aminosavösszetétel - aminosavsorrend - N-terminális aminosav - C-terminális aminosav 3. Térszerkezet (3D) meghatározása - szekunder (másodlagos) - tercier (szupermásodlagos) - quaterner

Fehérje izolálás – gélelektroforézis (egy- és kétdimenziós) Salmonella thyphimurium SDS-PAGE, 200 mg protein, 3,5 x 0,8 cm Autoradigram, 2D, E. Coli proteinek, 10 mg, 14C jelzett aminosav a táptalajban, 2,3 x 1,3 cm, exp. 825 h

Gélelektroforézis

Egydimenziós gélelektroforézis HeLa sejtmag fehérjék Swiss-Prot

Kétdimenziós gélelektroforézis (HeLa sejtmag fehérjék) Mw pI

Fehérjék kimutatása, mennyiségi meghatározása a) Amino csoport kimutatás b) Biuret próba Reagens: CuSO4/NaOH c) Lowry-Hartree Reagens: biuret + 3 H2OxP2O5x13 WO2x5 MoO3 10 H2O, Folin-Ciocalteu-fenol l = 540-550 nm l = 720-750 nm d) BCA (bicinoninic acid, Reagens: biuret + BCA l = 562 nm e) Bradford reagens (trifenil-metion) l = 595 nm

Primer szerkezet meghatározása 1. Diszulfid-híd felbontása

2. Aminosav összetétel meghatározása 2.1. Hidrolizis O O H2O / 6M HCl NH2-CH2- C NH2-CH2- C + NH-CH-COOH 105 oC NH-CH-COOH OH CH3 glicin Gly-Ala CH3 alanin 2.2. Elválasztás és származék- képzés Ioncserés kromatográfia, Rockefeller Intézet, 1950 Gyanta: vízben nem oldódó polimer SO3- csoportokkal Detektálás: ninhidrin reakció , l = 570 nm

2.3. Származékképzés és elválasztás Származékképzés: o-ftálaldehid Elválasztás:HPLC, Detektálás: lg = 360 nm le = 455 nm Hunkapiller et al. Science, 1984

1-fluor-2,4-dinitrofenil- 2.4. Származékképzés D/L-aminosav meghatározására * * + 1-fluor-2,4-dinitrofenil- 5-L-Ala-amid (FDAA) (D,L) pH 9,0; 10 perc * * * * D,L-származék L,L-származék HPLC elválasztás

3. Aminosav sorrend meghatározása 3.1. N-terminális 3.1.1. Sanger reakció, 1958, inzulin NO 2 2 NaHCO3 N H C H CO - + H 2 N C H CO - 4 R + HF R O 2 N 1-fluor-2,4-dinitro benzol NO 2 O N H C CO - R 6 M HCl + aminosavak 2,4-dinitrofenil fehérje 2,4-dinitrofenil aminosav l=254 nm

3.1.2. 1-dimetilamino-naftalin-5-szulfonil kloridl (Dansyl-klorid, Hartley, 1963) NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH + S O N C H 3 NH-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH bázis pH 7,5-8,0 +HCl S O N C H 3 NH-Leu-COOH + K, A, D, P, N, R, F, G-COOH 6 M HCl hidrolizis (Dansyl-aminosav) l g=360 nm l e=480 nm

3.3. Edman lebontás (P. Edman, Lund, 1950) 3.2. C-terminális NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH + H2N - NH2 sav, 90o C 20 -100 óra +NH3-L – CO -NH-NH2, +NH3-K-CO-NH-NH2.....+NH3-L-COO- 3.3. Edman lebontás (P. Edman, Lund, 1950) lépés: Reakció fenilizotiocianáttal (addició) lépés: Hidrolizis lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

+ lépés: Reakció fenilizotiocianáttal N = C = S NH2 - CH – CO -..... R pH 8-9, 40 oC S II NH - C - NH - CH – CO -..... R feniltiocarbamil származék 2. lépés: Hidrolizis (H+/TFA) anilinotiozolinon származék fenilhidantoin (PTH) aminosav

3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

4. Fehérjék feldarabolása 4. 1. Kémiai hasítás 4.1.1. Reakció brómciánnal (BrCN), Met - + H2O, H+ NH2-CH-COOH (CH2)2 OH homoszerin

4.1.2. Reakció hidroxilaminnal (NH2 - OH) Asp - Gly 4.1.2. Reakció 2-nitro-5-tiociano - benzoesav - Cys O2N N = C = S HOOC 4. 2. Enzimatikus hasítás Terminológia (Schechter, Berger) S4 – S3 – S2 – S1 – S1’ – S2’ - S3’ – S4’ – enzim P4 –P3 – P2 – P1 – P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – szubsztrát - P4 –P3 – P2 – P1 – OH + H- P1’ – P2’ - P3’ – P4’ – Szerin proteázok: tripszin (Arg, Lys) P1, trombin, kimotripszin (Tyr, Trp, Phe) P1, elasztáz, kallikrein.. Cisztein proteáz: papain, actinidin... Karboxil proteáz: pepszin, katepszin D (lizoszoma), LysC (Lys) P1, GluC (Glu, Asp)... Aminoproteáz: AspN (Asp)P1..... Metalloproteáz: temolizin, karboxipeptidáz A...

Primer szerkezet, aminosavsorrend - összegzés

Térszerkezet

Szerkezeti hierarchia

Az amid kötés Delokalizáció, 2 e, 3 atom Nomenklatúra Gyenge N bázis Erős H-híd Részleges kettős kötés Síkalkat Cisz/transz izoméria Nomenklatúra

A Ramachandran térkép - bevezetés

A Ramachandran térkép

Másodlagos szerkezet típusai

310 – hélix, alfa-hélix, pi-hélix Helikális szerkezet 310 – hélix, alfa-hélix, pi-hélix

Béta redőzőtt réteg szerkezet

Kanyar szerkezet

A Ramachandran térkép - összefoglalás

Konformerek energiatartalma Források : kötéshossz (Ed) – változatlan vegyértékszög (Eo) – változatlan torziós szög (Ew) - változik Nem kötött atomok távolsága (Ew) Kötő elektronpárok kölcsönhatása (Eh) Elektrosztatikus kölcsönhatás (Er) DE = DEd + DEo + DEw + DEw + DEh + DEe Példa: Fehérje 100 aminosavból ha: 10 konformáció/as lehetséges akkor: 10100 konformer b) ha: 2 konformáció/as lehetséges akkor: 1030 konformer

Szupermásodlagos szerkezetek Görög kulcs Béta kigyó Csoportosítás Alfa (a) csak alfa hélix Béta (b) csak béta réteg Alfa + béta ( a + b) hélix és réteg egymástól távol Alfa/béta (a/b) hélix és réteg egymással kölcsönhatásban

Negyedleges szerkezet - a kollagén

A protemika alapjai 1 . F e h é r j - x p s z i ó S t l á u m n k a v d o E g U C P c ( ) 2 + ö Z A T b , M y R I

A médium összetételének hatása az E-coli fehérjeösszetételére Arg - Arg Farrell PHO (1978)

Fehérje bioszintézise

A) B) Nem fehérje alkotó természetes aminosavak H 2 N C H COOH H 2 N C Glu dekarboxiláz C H 2 g-aminovajsav (GABA) C H 2 C H 2 HOOC HOOC Glu C H 3 Karnitin Zsiranyagcsere Mitokondrium transzport Sejtpermeabilitás + H 3 C N C H 2 + C-vitamin (máj) Lys/Met C H C H O H 3 C H 2 HOOC Állat Ember Növény + - B) b a b-Alanin C H 3 H O C H 2 C C H CO N H C H 2 C H 2 COOH O H H 3 C Pantoténsav

(citrullus lat görögdinye) H 2 N C H COOH H 2 N C H 2 1. – CO2 2. oxidáció Állat Ember Növény + - C H 2 C H 2 S H SO 3 H (máj, B6) cisztein taurin epesav alkotórész neurotranszmitter vérlemezke migrén? D) H 2 N C H COOH H N C H COOH argináz +H2O 2 (CH 2 ) + 3 (CH 2 ) 3 H 2 N C N H 2 H N C N H 2 N H 2 O N H ornitin karbamid (urea) arginin +NH3, + CO2 H 2 N C H COOH (CH 2 ) 3 urea ciklus (máj) hagyma, fokhagyma detoxifikáció H N C N H 2 O citrulin (citrullus lat görögdinye)

(N-metil-guanidino-ecetsav) H 3 H N C H 2 COOH szarkozin (izom) H2N-CN C H 3 H 2 N C N C H 2 COOH N H kreatin . H2O (N-metil-guanidino-ecetsav) op: 303 oC izom H2PO4-NH - (kreatin-foszfát)