Génsebészet Cseh Zsófia.

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
Utazás a sejtben Egy átlagos emberi sejt magja megközelítőleg 510-15 gramm mennyiségű és 1,8-2 méter hosszúságú (3000 millió bázispárnyi) DNS-ből,
Advertisements

„az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem”
KŐVIRÁG 6.
“Valós idejű” polimeráz láncreakció (RT-PCR)
Mutációk.
A polimeráz láncreakció Gurbi Bianka március 4. Emelt Biotechnológiai Számítások.
DNS replikáció Szükséges funkciók Iniciáció
Elektroforézis Általában agaróz a hordozó
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
DNS replikáció: tökéletes másolat osztódáskor
A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor.
Fehérjeszintézis Szakaszai Transzkripció (átírás)
Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül:
Oligonukleotid szintézis
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
Bakteriális genom térképezés Készítette: Mlinarics Edina IV. Biológus Bioinformatika SZIT.
Strukturális genomika Gyakorlati feladatok. SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?
Molekuláris genetika Falus András.
Nukleotidok, nukleinsavak
Polimeráz láncreakció (PCR)
Fluorescens in situ Hibridizáció
MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI
A kromoszómák működése, jellemzői:
Buccalis kenet a connexin-26 gén 35delG mutációjának non-invazív szűrésére kisgyermekeken Torkos Attila 1,2, Magnus Teschner 2, Peter Erfurt 2, Gerrit.
Öröklődés molekuláris alapjai
A λ bakteriofág +++. Kb db fág van a bioszférában Bakteriofágok vegetatív replikációs ciklusa.
Ahhoz, hogy dolgozni tudjunk égy adott génnel, vagy szekvenciával nagy mennyiségű DNS-re van szükségünk, ezért valamilyen módon „klónozni” kell, a gén.
Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós. : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének)
Polimeráz láncreakció
Készítette: Leidecker Orsolya
2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények.
DNS amplifikáció pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van
DNS chipek, DNS hibridizáció
FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ
Az izomdystrophiák molekuláris genetikai vizsgálata
A gélelektroforézis Alkalmazása: különböző molekulák (nukleinsavak, fehérjék) -méret szerinti elválasztását, -detektálását -mennyiségének meghatározását.
AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE. AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT Könnyű lánc (L) Nehéz.
Nukleinsavak és a fehérjék bioszintézise
Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás
Gyógyszerként használt fehérjék előállítása
Alapsokaság (populáció)
1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA
IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László.
A P elemek mobilitásának szabályozása
A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása
A P elem technikák: génmanipuláció tetszés szerint
Készítette: Czigléczki Gábor
Gyakorlati képzés: Genetikai variációk igazolása PCR segítségével.
Nukleinsavak énGÉN….öGÉN.
Adatbáziskezelés. Adat és információ Információ –Új ismeret Adat –Az információ formai oldala –Jelsorozat.
Escherichia coli baktérium
Molekuláris klónozás a gyakorlatban. CRISPR/Cas rendszerek Adaptív bakteriális immunitás Idegen nukleinsavak ellen ( pl. vírusok) Ezek integrálása a genomba,
DNS szintézis, replikáció Információ hordozó szerep bizonyítéka Avery-Grifith kísérlet Bakterifágos kísérlet.
34. lecke A fehérjék felépítése a sejtben. Lényege: Lényege:  20 féle aminosavból polipeptidlánc (fehérjelánc) képződik  A polipeptidlánc aminosav sorrendjét.
Primer tervezés qPCR-hez
Új molekuláris biológiai módszerek
Polimeráz Láncreakció:PCR, DNS ujjlenyomat
Géntechnikák labor kiselőadás Készítette: Nagy Zsuzsanna
KÓRHÁZI ACINETOBACTER BAUMANNII TÖRZSEK JELLEMZÉSE
Új molekuláris biológiai módszerek labor
Molekuláris biológiai módszerek
Új molekuláris biológiai módszerek
Proteomika, avagy a fehérjék „játéka”
Molekuláris biológiai módszerek
Új molekuláris biológiai módszerek
Molekuláris biológiai módszerek
A DNS replikációja Makó Katalin.
Készítette:Tóth Karolina
Új molekuláris biológiai módszerek
Biotechnológia, génmanipulációk, transzgenikus élőlények
Előadás másolata:

Génsebészet Cseh Zsófia

A cDNS tárak Plazmidba: 5 kbp DNS, a gamma fágba: 20 kbp DNS klónozható. (Az átlagos baktérium 1 kbp hosszú.) Genom kis része: gének Genom nagy része: intergénikus DNS-szakaszok Nem íródik át: intergénikus, promóter, intron szekvenciák

A cDNS tárak Készítése: Def.: Különféle cDNS-eket vagy cDNS-szakaszokat tartalmazó vektorok összessége. Készítése: 1.) Reverz transzkriptáz enzim az mRNS alapján komplementer szálat szintetizál complementer DNS= cDNS 2.) A teljes cDNS-t vagy annak egyes szakaszait vektorokba klónozzák.

Géntárak Olyan vektorok gyűjteménye, amelyek bár kis szakaszokban, de valamely faj teljes genomját tartalmazzák. Vektor: fágok és plazmidok (bakteriális), olyan DNS molekulák, amelyek alkalmasak idegen eredetű DNS szakaszok megsokszorozására. A genomikus géntárat alkotó rövid DNS-szakaszok bármelyike izolálható, és belőle tetszőleges mennyiségű DNS készíthető, használható különböző célokra.

Géntárak A génkönyvtárból ki kell tudni választani azt a klónt, amelyre szükség van. A kiválasztott klón szaporítható, majd kinyerhető belőle a nagy mennyiségű, klónozott DNS.

Géntárak Géntárak szűrése 1) Idegen DNS-t tartalmazó baktériumkolóniát készítenek. 2) A kolóniából baktériumokat visznek egy nitrocellulóz filterre. 3) A nitrocellulóz filtert NaOH-al kezelik  baktériumok feltárása  DNS denaturálása  egyszálú DNS kötése a filterhez

Géntárak 4) A DNS-t 90-95C0-on rásütik a filterre, hogy a DNS ne vesszen el 5) A filtert 32P-vel jelölt próbával inkubálják (vagy fluoreszcens molekulákkal). 6) Inkubáció alatt a próba próba DNS hibridizál a komplementer DNS-szekvenciákkal.

Géntárak 7) A nitrocellulóz filtert röntgenfilmmel borítják, így a 32P bomlása során létrejövő béta-sugárzás hatására fotokémiai reakció játszódik le a filmben. fekete ezüstszemcsék jelennek meg a film előhívása során. 8) A szemcsék megmutatják, hogy melyik kolónia tartalmazza a próbával komplementer DNS-szakaszt. 9) A megfelelő baktériumok az eredeti mesterlemezről izolálhatók, elszaporíthatók.

PCR (polimerase chain reaction) 10-12 kbp hosszú DNS-szakaszok nagy mennyiségű, in vitro elkészítését teszi lehetővé. Eppendorf-csőbe teszünk: Puffer Primerek Taq-polimeráz enzim dATP, dTTP, dGTP, dCTP

PCR Primer: 20-30 pb-ból álló egyszálú, szintetikus oligonukleotid, amely komplementer a templát DNS valamely szakaszával. PCR: Három különböző hőmérsékleten történő folymat ismétlődése.

PCR 95 C0 DNS denaturálódása 60 C0 primerek kapcsolódása a komplementer DNS-szekvenciákkal. 72 C0 Taq-pol optimális működési hőmérséklete, komplementer DNS szintézise a primertől kiindulva. Exponenciális növekedés: 1 ciklus DNS kettős spirálok száma megkétszereződik: n db ciklus 2n DNS-spirál (30-40 ciklus)

PCR Primer: Olyan rövid szekvenciák, amelyek a sokszorozni kívánt DNS két végével komplementerek és 3’ végük egymás felé néz. Azonos olvadási hőmérséklettel kell rendelkezniük és feltétel, hogy nagy fölöslegben kell legyenek.

PCR Taq polimeráz Működési optimuma: 72 C0 Nem károsodik 95C0-on

PCR Denaturálás 95 C0 DNS kettős szála felbomlik egyszálú DNS

PCR Túlnyúló végek a ligáláshoz

PCR

PCR

PCR RT-PCR: Az mRNS minták alapján először a reverz transzkriptáz enzim szintetizál az mRNS-nek megfelelő DNS-t, majd a kapott DNS –szakasz elszaporíthatő a megfelelő primerekkel.

RFLP Restrikciós enzim: meghatározott szekvenciát ismer fel és vágja el ennek mentén a DNS-t  restrikciós fragmentek képződnek. Restrikciós fragment: hossza egyenlő restrikciós helyek egymástól mért fizikai távolságával. Elkülönítésük: gélelektroforézissel A hosszabb fragmentek rövidebb utat, a rövidebb fragmentek hosszabb utat tesznek meg. Az azonos hosszúak egy sávot képeznek. A sávok helyzete fordítottan arányos a restrikciós fragmentek hosszának logaritmusával.

RFLP (restrikciós fragment hosz polimorfizmus) Gélelektroforézis:

RFLP Sávok láthatóvá tétele: 1) DNS-hez kapcsolódó festékkel: etidium-bromid UV-fényben narancssárgán fluorszkál. 2) DNS/DNS vagy DNS/RNS hibridek kimutatásával, jelzett próbával való hibridizáció útján.

RFLP (restrikciós fragment hossz polimorfizmus) A populációban sok génnek sok allélja létezhet egyidejűleg  a populáció az adott tulajdonságot illetően polimorf. A mutációk restrikciós helyeket szüntetnek meg és újakat hoznak létre, megteremtve a DNS polimorfizmus alapját.

RFLP Tkp a DNS polimorfizmusa valamely restrikciós hely meglétét vagy hiányát jelenti a DNS ugyanazon szakaszán a homológ krsz-ák DNS-ében. Ez azt jelenti, hogy a faj különböző egyedeiből származó homológ krsz-ák DNS-ének adott pontján valamely restrikciós hely jelen van-e vagy sem.  Valamely restrikciós enzimmel folytatott emésztés során eltérő hosszúságú restrikciós fragmentek képződnek.  A különféle hosszúságú restrikciós fragmentek eltérő gyakorisággal lehetnek jelen a különböző populációkban.

RFLP Minden ember genetikailag egyedi kombináció, egyedi RFLP-mintázat jellemző minden egyes emberre személyek azonosítása. Alkalmas módszer a a krsz-ák jól definiált pontjainak azonosítására. A marker mutációk géneket azonosítanak, viszont az intergénikus szakaszok is bőségesen tartalmaznak restrikciós helyeket.

RFLP Alkalmas: Genetikai eredetű tulajdonsá- gok vizsgálata Prenatális diagnosztika Személyek azonosítása Tájékozódási pontok a krsz-ák mentén

Restrikciós endonukleázok Restrikciós enzimek: azon baktériumok után nevezik el, amelyekből izolálják őket. Pl.: EcoRI (Escherichia coli RY13) EcoRV az (Escherichia coli R)

Restrikciós endonukleázok A baktériumokban kifejlődött restrikciós-modifikációs rendszer felfedezése tette lehetővé az irányított, reprodukálható, in vitro DNS szabás-varrást és a technikán alapuló DNS-klónozást. A restrikciós-modifikációs rendszer két különböző enzimaktivitáson alapszik.

Restrikciós endonukleázok A restrikciós enzimek meghatározott sorrendű bázispárokból álló egységet (palindrom szekvenciák) ismernek fel a DNS-spirál kettős spirálon és a felismerő helyen, vagy annak közelében hasítani képesek a kettősláncú DNS molekulát. A "restrikciós" szó ezen enzimcsoport nevében a baktériumban betöltött szerepükre utal: a restrikciós enzimek feldaraboljak a gazdasejtbe bejutó idegen DNS-t (pl. bakteriofág DNS-e), "restriktív" körülményeket teremtve számukra.

Restrikciós endonukleázok DNS metilázok: Metil-csoportokkal jelölik meg a baktériumok saját DNS-ét a baktérium restrikciós endonukleáza által felismert szekvenciánál. A módosítás lehetetlenné teszi az endonukleázok működését, "védik" a DNS molekulát. A baktériumokba bejutott idegen DNS molekula viszont nincs a megfelelő helyen metilálva, és áldozatul esik az endonukleázoknak.

Restrikciós endonukleázok A génmanipulációs kísérletekben olyan restrikciós endonukleázokat használnak, amelyek reprodukálhatóan, a felismerőhelyen belül hasítanak. Ezek az enzimek 4-8 bp méretű specifikus szekvenciákat ismernek fel (restrikciós helyek), amelyek palindromok: 5'-3' irányban mindkét szálon ugyanaz a bázisok sorrendje.

Restrikciós endonukleázok A restrikciós enzimek egy része úgy vágja a DNS-t, hogy rövid, egyszálú, komplementer végek keletkeznek a hasítás helyen. Ezek a "ragadós" végek nagy szerepet játszanak a rekombináns DNS-technikákban, mert könnyen újra összetapadnak ugyanazon vagy más DNS-darabok ugyanolyan ragadós végeivel. A párosodott szekvenciák a DNS-ligáz nevű enzim segítségével stabilan összekötik a két DNS-fragmentet.

Restrikciós endonukleázok A restrikciós enzimek másik csoportja a DNS-t a felismert szekvencia középpontjában vágja, így „tompa” végek keletkeznek, amelyek - miután hiányoznak az összekapcsolódást megkönnyítő túlnyúló komplementer szálak - igen nehezen tapadnak újra össze. Előnyük azonban, hogy ebben az esetben csak annyi szükséges az összekapcsolódáshoz, hogy mindkét vég „tompa” legyen.

Restrikciós endonukleázok TOMPA VÉG RAGADÓS VÉG

Restrikciós (=fizikai térképek) Def.: Olyan ábrázolásmód, amely megmutatja a különféle restrikciós enzimek hasítési helyei milyen sorrendben követik egymást a DNS mentén. Készítése során egy adott DNS-szakaszt különféle restrikciós enzimekkel emésztenek külön-külön és együtt is. Az emésztés során képződő fragmenteket elkülönítik, meghatározzák a fragmentek méretét. Méret alapján a fragmenteket sorrendbe rendezik térkép

Restrikciós (=fizikai térképek) A restrikciós helyek helyzete, egymástól mért távolsága arányos az emésztés során képződő fragmentek hosszával, a DNS-t alkotó bp-ok hosszával. Nemcsak gének térképezését, hanem molekuláris klónozásukat is lehetővé teszik.

Southern blott Def.: Fragmentek detektálása jelzett DNS-próbával. 1) Nitrocellulóz (vagy nylon) filterre blottolják a gélelektroforézissel elkülönített fragmenteket. Blottolás= gélből a filterre szívják a DNS-fragmentet. 2) NaOH-kezelés 3) 10 min 90-95C0  denaturáció 4) Egyszálú DNS filterre kötése

Southern blott 5) 32P próbával (vagy fluoreszkáló molekulákkal) inkubálás (komplementer az egyszálú DNS-sel) 6) Mosás (nem hibridizált DNS eltávolítása) 7) Röntgenfilm készítése 32P elbomlikradioaktiv béta-sugárzás fekete ezüstszemcsékként látszik a filmen.

Northern blott RNS molekulák elkülönítése, izolálás, gélelektroforézis, nitrocellulóz szűrő, sütés. DNS próbával kimutathatóak azok, amelyek hibridizáltak a a DNS-próbával.

Western blott

Western blott Fehérjemolekulák elkülönítésére használatos technika, elve ua., mint a Northern blottolásé, itt azonban specifikus ellenanyaggal kezelt DNS-próbával detektálják és teszik láthatóvá a keresett fehérjemolekulát.

FISH(fluoreszcens in situ hibridizáció) Specifikus kromoszómális DNS-szakaszt láthatóvá tevő technika. A komplementer nukleinsav szekvenciák akkor is hibridizálnak egymással, ha az egyik DNS-fonal egy krsz része. A hibrid molekula FISH módszerrel láthatóvá tehető, és mikroszkópban tanulmányozható. A hibrid szakasz kimutatása különleges erősítést igényel, hogy tanulmányozható legyen.  immunglobulin-GFP  DIG

FISH DIG (=digoxigén): DNS próbát megjelöljük ezzel, a próbát a DIG-en keresztül egy elsődleges ellenanyag ismeri fel. Ez az ellenanyag a DIG-gel specifikusan reagál. Az elsődleges ellenanyag molekulái másodlagos ellenanyaggal kapcsolódnak, amelyek fluoreszcens anyaggal jelzettek.

FISH A próba-DNS sok DIG-et tartalmaz, és a DNS hibrid több elsődleges ellenanyaggal kapcsolódik, amely elsődleges ellenanyag több másodlagos ellenanyaggal kapcsolódik. A másodlagos ellenanyag sok floureszcens anyaggal van megjelölve  szendvics szerkezet: kellő intenzitással fluoreszkál, amely fluoreszcens mikroszkópban tanulmányozható.

FISH

FISH

VNTR Eukromatinban: a rövid DNS szekvenciák tandem módon ismétlődve vannak elrendeződve. VNTR: mérsékelten repetitív szekvencia osztályába tartozik. Ismétlődő szekvencia: = mikroszatellit vagy VNTR (variable number of tandem repeats) Az egyes kópiák száma a VNTR-blokkokban és az egyes emberekben is különbözőek Igazságügyi orvostanban személyes azonosítására használják.

VNTR

VNTR analízis

VNTR analízis 1) VNTR amplifikálása PCR módszerrel (apai és anyai eredetű krsz-ból származó DNS alapján). A PCR primerek azon DNS szekvenciáknak komplementerei, amelyek közvetlenül a VNTR szomszédságában vannak. A PCR termék hossza függ: a VNTR-ben ismétlődő „egység” hosszától a kópiák számától. 2) Gélelektroforézis Az „egység” DNS szakasz hosszának ismeretében és a PCR termék mérete lapján meghatározható a kópiák száma.  Adott emberre jellemző mintázat képződik. Érzékeny technika: egyetlen hajhagyma vagy vércsepp alapján elvégezhető a VNTR analízis.