Animált bemutató, ajánlott bekapcsolni a diavetítést (pl. az F5-öt megnyomni) Utána szóközzel v. PageUp PageDown gombokkal léptetni

A koncentráció meghatározása Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl:  szín (abszorbancia, optikai denzitás)  fluoreszcencia  sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

koncentráció Ismeretlen koncentrációjú minta OD A standard hígítási sora (szigmoid görbe) Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

OD Becslés „vonalzóval” standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) Az a tartomány, ahol az abszorbancia arányos a koncentrációval 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai azonos OD-hoz tartozó pontok A két csőben azonos a koncentráció Az 1.9μg/ml-re hígított standard megfelel a… … 128-szorosra hígított ismeretlen mintának Tehát az (eredeti hígítatlan) ismeretlen minta koncentrációja: 1.9x128 = 243.2μg/ml

OD standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) 2X4X8X16X32X64X128X256X Ismeretlen minta hígításai Ha felírjuk az egyenes szakaszok egyenleteit, eltehetjük a vonalzót, és elővehetjük a számítógépet y std =mx+b Y minta =mx+b Vegyük észre, hogy az x tenglyek eltérő skálázása miatt (piros ill. kék feliratok), a két egyenes nem párhuzamos egymással!

Durva hibák Tudatában kell lenni, hogy milyen abszorbancia érték tartományban használhajuk fel az OD értéket, ha egy egyenletbe szeretnénk visszahelyettesíteni, és az alapján koncentrációt számolni! Hígítási görbe Illeszett egyenes, egyenlettel y=mx+b  OD=m(koncentráció)+b OD koncentráció Bármely töménységű oldat kellően nagy hígításának OD-je erre a részre fog esni. Az egyenletbe ezt az OD értéket behelyettesítve, és ez alapján a hígítást is figyelembevéve (visszaszorozva), óriási – hamis! – koncentációt kapunk eredményül Hasonló mondható erről az értékről is A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek

Hígítási görbe OD koncentráció A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek Ne erőltessük az egyenes illesztést ott ahol felesleges hibásan illesztett egyenes Az egyenest is ezekre a pontokra kell illeszteni

Vegyük észre, hogy a hígítás/koncentráció tengelye a korábbi ábrákon logaritmikus ábrázolású volt! Ugyanannak a sorozathígítással kapott mérésnek az ábrázolása: Normál (lineáris) hígítási tengellyelLogaritmikus hígítási tengellyel A jó ábrázolás segít a kiértékelésben, segíti megtalálni azokat a pontokat, amikre egyenes illeszthető!

hígítás: hígítás 2 x : =

A jó ábrázolás segít a kiértékelésben Próbáljuk meg meglátni a hígítási sorozatokban a „szigmoid görbe” megfelelő részeit, és ennek megfelelően illeszteni az egyenest

A gyakorlatban csak ritkán adatik meg, hogy szép sztenderd hígítási görbével dolgozhassunk. Az ismeretlen mintából sem szokás teljes szigmoid görbét kiadó hígítási sorozatot készíteni. Általában csak 2-3 féle hígítást készítünk belőle. 1x2x4x8x16x32x64x128x OD standard (1x: 100  g/ml) hígítás az ismeretlen minta hígításai hígítás1x10x100x OD érzékenységi küszöb körüli érték 2.1 kb. 5 (a pontos érték kiszámításához pl. a két pont közti egyenes egyenletét lehetne felhasználni) 100/5 = 20  g/ml az ismeretlen 20x10 = 200  g/ml

Ebben a példában a hígítatlan (1x) ismeretlen minta OD értéke valószínűleg nem lett volna használható. 1x2x4x8x16x32x64x128x OD standard (1x: 100mg/ml) hígítás az ismeretlen minta hígításai hígítás1x10x100x OD A 4.0 OD érték körüli érték a legtöményebb sztenderd hígítási pont! Lehet, hogy a sztenderd hígítási görbe valójában más lefutású! pl. ha a hiányzó 2x hígítás ide esik Ez a szigmoid görbe felső plató része! Felhasználjuk-e a megmaradt adatpontot?