1 OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA Festékpróbák az anyagtudományban (KM), szept Képalkotó eljárások (VT), okt Fotokróm anyagok (BP), okt Fotodinámiás terápia (VT), okt Nem-lineáris lézerspektroszkópia (KT), okt Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), nov Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (KM), nov. 14.

2 ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni) Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

3 Festékpróbák Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák

Jablonski-diagram

5 Reichardt’s dye

6 „charge transfer” festék C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, (1994)

7 A Reichardt-festék abszorpciós színképe 90 %-os (m/m) glicerin-víz elegyben (GW), ionos folyadékban (IL), acetonitrilben (ACN) és diklórmetánban (DCM). K.A. Fletcher, Green Chem. 3, (2001)

8 S0S0 = 810 nm Ph-O-Ph = 453 nm H 2 O S1S1 Oldószer polaritás

9 skála Az oldószer polaritását jellemzi.

10 Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban  + 78  C max = 568 nm - 78  C max = 513 nm Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban  1 bar max = 547 nm 10 kbar max = 520 nm

11 A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

12 Fluoreszcens festékpróbák J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999

Vázlat 13  Műszerek stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás  Statikus kioltás  dinamikus kioltás  oldószer polaritás / hőmérséklet / viszkozitás hatása  Lippert-egyenlet  vibrációs relaxáció  oldószer relaxáció  kettős fluoreszcencia  feherjék fluoreszcenciája / triptofán FRET rotációs diffúzió (orientációs relaxáció)

14 Spektrofluoriméterek -stacionárius - időfelbontásos (  F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)

15 Stacionárius

16 Időkorrelált egyfoton-számlálás

17 Fluoreszcencia lecsengési görbe

18 Statikus kioltás

19 Oxazin1 + receptor

20

21

22

23 Dinamikus kioltás

24 Lakowicz, p. 461

25 Lakowicz, p. 461

26 M + h M +  M + Q M*M*

27 A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval

28 Stern-Volmer egyenlet

29 Oldószer polaritása és hőmérséklete

30 S0S0 S1S1 Oldószer polaritás

31 Polaritás hatása: Lippert-egyenlet + _ a  G v.  E

32 Lippert-egyenlet + _ a  G v.  E

33 Naftilamin-származékok Stokes eltolódása Lakowicz, p. 191

34 S0S0 S1S1 vibrációs relaxáció s oldószer relaxáció oldószer relaxáció s abszorpció s emisszió s Hőmérséklet hatása: folyamatok Jablonski-diagramon

35 Patman C CH 3 (CH 2 ) 14 O CH N(CH 3 ) 3 + A Prodan lipofilizált + ionos változata

IFIF [nm] Lakowicz, p Oldószer relaxáció sebessége kisebb, ha csökken a hőm. - a sáv -30  C-on a legszélesebb: kettős fluoreszc.

37 Kettős fluoreszcencia DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201

38 Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán

39 Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, pH 7) Lakowicz, p. 446

40 Lakowicz p. 453 A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára 1)Apoazurin Pfl 2)T1 ribonuklease 3)staphillococcus nuclease 4)glucagon

41 Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

42 Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

43 Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r 6 -nal arányos

44 Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

45 Akceptor Donor: EtBr (etidium bromid)

46 EtBr abszorpció BODIPY fluoreszcencia

47 Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni

48 Festékmolekula orientációs relaxációja + _ a  G v.  E

49 Hidrodinamikai súrlódás járuléka Stokes-Einstein-Debye egyenlet

50 Dielektromos súrlódás járuléka

51 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága (  ) 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

52 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán