Géntechnikák labor kiselőadás Transzgenikus élőlények, alkalmazásuk: betegségmodellek, expressziós rendszer Géntechnikák labor kiselőadás Balogh Judit 2008. március 13.

Transzgenikus élőlény: Olyan rekombináns élőlény (növény vagy állat), melynek genomjába egy idegen (más organizmusból származó) gén lett beépítve. 1. Transzgenikus növény előállítása: 1983 Transzgenikus állat: 1982 patkány növekedési hormonját (RGH) termelő egér (Cd-mal aktiválható promoter)

Transzgenikus élőlények létrehozása: Növények: Totipotens sejtek egy izolált sejtből regenerálható a teljes növény - talajbaktériummal való fertőzés (Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidja épül be a növény genomjába) vektor nélküli sejtbe juttatás: protoplaszt transzformálás mikroinjektálás génpuska

Állatok: Transzgenikus állat létrehozásához a petesejtet, spermiumot, vagy a megtermékenyített zigótát kell transzformálni. mikroinjekció: mikroszkópra szerelt mikromanipulátorral - transzfekció, vírus közvetítésével bejuttatott DNS (csirkeembrió) DNS tumorvírus: SV40, polioma vírus, adenovírusok, vaccinia vírusok, retrovírusok biolisztika/génpuska (halpeték, nyúlembriók) embrionális őssejt közvetítéssel - fizikai módszerek: elektroporáció Ca3(PO4)2–os komplex - transzómia: mesterséges kromoszómával (YAC)

Transzgenikus élőlények alkalmazása: Mezőgazdaság nemesítés: új tulajdonságok több tej, kisebb laktóztartalmú tej, több hús rezisztencia betegségekkel szemben, rovarölőszer termelés (növények) Egészségügy xenotranszplantáció: nem emberi sejtek, szövetek, szervek beültetése emberbe expressziós rendszer: a bevitt gén által kódolt fehérje nagy mennyiségű előállítása humán génterápia: hibás vagy hiányzó gén okozta genetikai betegségek gyógyítása humán betegségek vizsgálata (betegségmodellek): AIDS, cukorbetegség, neurodegeneratív betegségek, cisztás fibrózis Ipar polimerszálak előállítása: pók géneket juttattak kecskébe selyemszerű fonalat választott ki a tejébe

Expressziós rendszer Állatok testnedveiben (vér, tej) nagy mennyiségben termeltethetők egyes gyógyászati alapanyagok, amelyek amúgy csak igen költségesen állíthatók elő (pl. emberi vérből, állati szövettenyészettel). Tejből viszonylag olcsón kivonhatók és tisztíthatók a fehérjetermészetű anyagok. A humán gyógyhatású fehérjék transzgenikus élőlényekkel való előállítása a költségek csökkenését, valamint minőségi és mennyiségi fejlődést jelent. Biopharming: a kívánt fehérjét bioreaktorként termelő klónozott állományok előállítása. Főbb transzgéntermékek: inzulin növekedési hormon humánszérumalbumin α-1-antitripszin (cisztikus fibrózis kezelése) anti-thrombin III VIII-as véralvadási faktor (hiánya hemofília A) IX-es véralvadási faktor (hiánya hemofília B) laktózszegény tej előállítása (laktóz intolerancia) emberi („humanizált”) anyatej előállítása (1997. Rosie: 2,4 g/l humán α-laktalbumin)

Human

Transzgenikus állatok előnyei az emlőssejttenyészettel szemben: Nincs fermentor (steril tenyésztés) Nincs drága tápközeg igény Nincsenek zavaró fehérjék, endotoxinok, sejtmaradványok Transzgenikus növények: 1989. 1. állati fehérje előállítása növény által Előnyei: - hatékonyság (gyorsabb, olcsóbb, egyszerűbb) - biztonság (patogének) - rövidebb termesztési idő - nagyobb mennyiség - stabilitás Hátrányai: - fehérjeszintézis korai terminációja - glikozilezés - nehezebb célzott expresszió (levél, mag) Klinikai tesztelés alatt lévő termékek: IgA antitest Humán lizoszóma enzimek Vírusmentes humán hemoglobin

Tejbe kiválasztott transzgenikus termékek: α-glükozidáz: glikogén glükózzá alakítása izmokban enzim hiánya: izomsorvadás előállítás: transzgenikus nyúl anti-thrombin III: véralvadás szabályozása felhasználás: vérrög kezelése előállítás: transzgenikus kecske Húgyhólyag mint bioreaktor (kiválasztás vizeletbe): Hím és nőstény állat is, egész életük során képesek expresszióra. Vizelet kevés fehérjét és lipidet tartalmaz könnyebb terméktisztítás De: csak kisebb mennyiségű fehérje előállítására alkalmas eddig csak egérben sikerült megoldani Csirke petevezeték mint bioreaktor: Előnyei: - könnyű termékbegyűjtés - rövid generációs idő - olcsó - nagy mennyiség - biztonság De: a csirkeembrió mikromanipulációja nehézkes

Betegségmodellek Emberi betegségeknek transzgénikus laborállatokon való modellezése. Tanulmányozható különböző ritka betegségek kialakulása, lefolyása. Így elkerülhetők az embereken végzett kísérletek, valamint a transzgenikus állatok (főleg egerek) alkalmasak új gyógyszerek, kezelések kipróbálására is. Génkiütéses módszer A knockout vagy génkiütési technika: a klónozott gént célzottan elrontják, majd homológ rekombinációval az állatba visszajuttatják, ily módon az egészséges gént betegre cserélik. Így vizsgálható: neurodegeneratív betegségek AIDS kutatás: Humán CD4 gént ültetnek egérbe, így HIV vírussal fertőzhető lesz. Az egér saját immunrendszerét tönkreteszik besugárzással vagy a limfocitákban expresszálódó transzgén (toxin) bevitelével. Diabetes: A bevitt toxin gén a hasnyálmirigy Langerhans szigeteiben fejeződik ki, elpusztítva a sejteket.

Rákos megbetegedések: Rákos megbetegedések: Megfelelő onkogén beültetésével specifikus rák alakítható ki. Onkomouse (Harvard): myc onkogén tanulmányozása Immunrendszer megbetegedései: Immunsejtek tönkretételével vagy idegen fehérjék beépítésével. Pl.: allergia, arthritis Neurodegeneratív betegségek: Alzheimer-kór, Parkinson-kór, Huntington-kór, multiszisztémás atrophia, trinukleotid ismétlődési rendellenességek, sclerosis multiplex, Lewy-test betegség Használt modell élőlények: patkány, egér, Drosophila. De egyik modell sem tudja a betegségek összes klinikai-patológiai elváltozását reprodukálni. A legtöbb Alzheimer-kór modell a betegséget okozó mutáns gének célzott túlexpresszióján alapszik. A gént általában adenovírus vektor segítségével juttatják be az embrióba vagy egyenesen az állat agysejtjeibe, és a vektorba konstitutív vagy szabályozható promotert is beépítenek. Új kezelések vizsgálata: antiaggregációs szerek, vakcinák, neuroprotektív ágensek, amyloid prekurzor termelő enzimeket gátló molekulák. A kezelésekre adott biokémiai, neuropatológiai és viselkedésbeli válaszokat vizsgálják. A transzgenikus rágcsálók ígéretes modellek új, hatékony kezelések kifejlesztésére.

Xenotranszplantáció Nem emberi sejtek, szövetek, szervek beültetése emberbe. Sertés a legalkalmasabb: szerveinek mérete hasonló az emberéhez, kevesebb közös kórokozó van és a társadalom jobban elfogadja etikailag. Legfőbb gond az idegen eredetű szövet kilökődése. Az immunválasz kialakításában döntő szerepe van az emlősök endoteliális sejtjeinek felületén található α-galaktozil epitópnak. Az epitópért felelős állati gén emberire cserélésével létrehozott transzgenikus állatból származó szervet az emberi szervezet nem idegenként ismeri fel. További problémák: a rövidebb élettartamú állat szerve mennyire lesz tartós az eredetileg horizontális helyzetű szív képes-e megfelelően működni az emberi szervezetben veszélyes vírusok kerülhetnek az emberi populációba

Köszönöm a figyelmet!