Bioszenzorok Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadás Kállai Brigitta 2014. április 22.

Bioszenzorok Szenzorokkal mérhető és szabályozható paraméterek: oldott oxigén és szén-dioxid, pH, redoxpotenciál, hőmérséklet, habszint, keverés. Első fejlesztések: Biomassza meghatározása in situ optikai denzitás méréssel; Fejlődő gáz analízis; Illékony komponensek detektálása (pl. metanol). Bioszenzorok: Nem illékony szubsztrátok és metabolitok mérése; Egyetlen analitikum mérése még komplex mátrixokban is.

Bioszenzorok A mintavétel és analízis között eltelt idő összhangban kell legyen a folyamat idejével Baktériumok tenyésztése során pár perc, Lassabban szaporodó emlős sejtek esetében 1-2 óra, Immobilizált enzimet alkalmazó reaktor esetében pár másodperc. Alkalmazás: In situ (sterilizálás probléma); Szűrést követően (analízis körülményei nem egyeznek meg a fermentáció körülményeivel); Alternatíva: automata analizátorok (FIA, flow injection analysis) Előnyök Hátrányok Kisebb befertőződési veszély Membrán eltömődhet Rövid válaszidő Minta hígítására szükség lehet Kis mintatérfogat elégséges pH beállítása analízis előtt Automatikus kalibráció Idővel szenzor inaktiváció

Bioszenzorok általános felépítése Jelerősítés JEL PC Külső membrán pl. dialízis membrán P Biológiai érzékelő (Biokatalizátor) Jelátalakító (Transzducer) Jel: pH-változás, Felszabaduló gáz, Fényemisszió Tömegváltozás Stb. Potenciometriás Amperometriás (Konduktometriás) Termikus Optikai Teljes organizmusok Szövetek Sejtek Organellumok Enzimek Antitestek

Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM) Szubsztrát, mint analitikum Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (98. oldal)

Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM) Ha nincs közvetlenül mérhető változás: indikátorreakció! elnyelési max. Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (98. oldal)

Enzimek Kvantitatív: Michaelis-Menten kinetika Specifikus reakciók; Minimális mintaelőkészítés; Michaelis-Menten kinetika Szilárd felszínen történő rögzítés (immobilizációs stratégia) Cél: Az enzim lehető legmagasabb aktivitása Hosszú stabilitási idő Rögzítést követően kis távolság a jelátviteli egységtől Fizikai: gélbe zárás, adszorpció Kémiai: kovalens kötéssel, keresztkötéssel, immobilizáció polimer filmbe

Fizikai: gélbe zárás Gélképző polimerek pl. alginát, kitozán, akrilamid Enzimtartalmú oldat + nátrium-alginát összekeverése Csepegtetés Ca2+ ionokat tartalmazó pufferbe Kálcium-alginát nem oldódik vízben, a golyócskák bezárva tartalmazzák az enzimmolekulákat. Előny: bármilyen enzimre alkalmazható Hátrány: Frissen kell elkészíteni Lassú a szubsztrát/termék transzport, hosszú a reakcióidő Enzimek folyamatosan elvesznek (póruseloszlás miatt), csökken az enzimaktivitás Polimer szerkezete megváltozik (zsugorodhat/duzzadhat a környezet ionerősségétől függően)

Fizikai: adszorpció Mi a probléma? Előny: nincs szükség további reagensekre, minimális aktiváció Hátrány: gyenge kölcsönhatások → érzékeny a környezezet megváltozására (pH, hőmérséklet, ionerősség, polaritás) Modell: minden egyes a felülettel érintkező molekula adszorbeálodik és koncentráció gradiens alakul ki. Mi a probléma? A modell nem veszi figyelembe a parciális telítettséget, ekkor a deszorpció kedvezményezett. Alkalmazás: egyszer használatos szenzorok (nem igényelnek hosszú távú stabilitást)

Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim Előny: irreverzibilis (stabil) Kémiai kötés - a fehérje funkcióit nem befolyásoló aminosav oldalláncokkal (karboxil, hidroxil, tiol, imidazol, fenol) I. Fémelektródokhoz elektródfelület aktivációja: Fém + szilán → stabil –M-O-Si- kötés enzim kötődése az aktivált elektród felülethez → amid kötés Aktivált enzim (BIM) Szilikátokhoz hasonlóan M-OH kötések, ahol M a fém Vízmentes körülmények között Stabil –MOSi-

Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim II. Szénelektródokhoz Felületi hidroxil csoport + cianur-klorid (2,4,6-Triklór-1,3,5-triazin) → szerves oldószerekben és vizes oldatokban stabil éter-kötés Cianur-klorid + hidroxil, amino csoport Pl. torma peroxidáz rögzítése grafit részecskék felületéhez Szilikátokhoz hasonlóan M-OH kötések, ahol M a fém Vízmentes körülmények között Stabil –MOSi-

Kémiai: keresztkötéssel http://synapses.clm.utexas.edu/lab/howto/cross-linking%20fixatives.pdf

Kémiai: immobilizáció elektrokémiai polimerizációval Monomer (pirrol, tiofén) → gyök → polimer In situ polimer film elektrokémiai iniciációval A vizes oldatban jelenlévő enzimmolekulák bezáródnak a növekvő polimer mátrixba Előny: Rugalmas módszer, könnyen kontrollálható Egyszerűen megvalósítható Magas enzimaktivitás Akár több réteg is növeszthető, több enzim immobilizálható Elektród felületéhez lokalizálódó polimerek: polianilin, polifenolok, polipiridin

Bioszenzorok általános felépítése Jelerősítés JEL PC Külső membrán pl. dialízis membrán P Biológiai érzékelő (Biokatalizátor) Jelátalakító (Transzducer) Jel: pH-változás, Felszabaduló gáz, Fényemisszió Tömegváltozás Stb. Potenciometriás Amperometriás (Konduktometriás) Termikus Optikai Teljes organizmusok Szövetek Sejtek Organellumok Enzimek Antitestek

Jelátalakító: potenciometriás Azt a potenciálkülönbséget méri, mely fellép az ion-szelektív membrán két oldalán. Egy ion-szelektív elektródra mindig érvényes összefüggés: E – mért potenciál R – egyetemes gázállandó T – abszolút hőmérséklet n – ion töltése ai – adott ion aktivitása Ionszelektív elektród kalibrációs egyenesének meredeksége standard hőmérsékleten és nyomáson: 59/n mV Például: karbamid detektálásához ureáz enzim Ionszelektív elektród: pH, NH3, CO2

Jelátalakító: potenciometrikus enzimelektród felépítése Mérőelektród: pH-üvegelektród Üveggömbre felhordva a gélben rögzített enzim Enzimes reakció sztöchiometrikus protonképződéssel vagy NH3 felszabadulással jár (segédelektród) Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (100. oldal)

Jelátalakító: amperometriás Biokatalizátor Jelátalakító: amperometriás Azt az áramot méri, ami az elektródon fellép egy adott potenciálon. Ez a mért áram egyenes arányban áll a kérdéses anyag oldatbeli koncentrációjával. Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz Első generációs: A termék keletkezésének vagy a reakciópartner fogyásának figyelemmel követésével következtetünk a vizsgálandó anyag koncentrációjára. Biokatalizátor: FADH2-oxidáz + O2  → FAD-oxidáz + H2O2  Elektród: H2O2   → O2 + 2H+ + 2e- http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html

Jelátalakító: amperometriás Biokatalizátor Jelátalakító: amperometriás Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz Mi a probléma? Oxigén tenziójának helyi ingadozásai (pH, hőmérséklet, ionerősség megváltozása miatt) Endogén anyagok nem-specifikus oxidációja miatti hidrogén-peroxid mérés Megoldás: mediátorok alkalmazása http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html

Jelátalakító: elektronátadó sók Elektronátmenettel járó enzimes reakciók (NAD, FAD mediált reakciók): elektronátadó sók Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (101. oldal)

Jelátalakító: amperometriás Biokatalizátor Jelátalakító: amperometriás Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz b) Második generációs: Mediátorral módosított, a mediátor redox tulajdonságai segítik az elektrontranszfert az enzim és az elektród felülete között. Biokatalizátor: FADH2-oxidáz + 2 Ferrocénium+ → FAD-oxidáz + 2 Ferrocén + 2H+ Elektród: 2 Ferrocén   → 2 Ferrocénium+ + 2e-  A reakcióban felszabaduló elektronok ferrocén közvetítésével jutnak az elektródhoz. http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html

Jelátalakító: amperometriás Biokatalizátor Jelátalakító: amperometriás Enzimes redox reakció: Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz b) Harmadik generációs: Direkt enzim-elektród kapcsolat, az elektród közvetlenül felhasználja a reakcióban felszabaduló elektronokat. Biokatalizátor/elektród: FADH2-oxidáz → FAD-oxidáz + 2H+ + 2e- http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html

Jelátalakító: amperometriás – glükóz elektród Oldott oxigént mérő elektród membránfelületére rögzített glükózoxidáz és kataláz enzim Membrán határolja, mely a meghatározandó szubsztrátra (glükózra), és a termékre (glükonsavra) is áteresztő Reakció során csökken a gélben az oldott oxigén koncentrációja, amit az oxigénelektród detektál. Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (100. oldal)

Jelátalakító: termikus Az enzim által katalizált kémiai reakció hőenergia változását követik (exoterm reakciók, 5-100 kJ/mol) A modern termisztorok 0,0001°C különbséget is képesek rögzíteni Hátránya: Nem-specifikus hőhatások miatt a szubsztrát koncentráció túlbecslése (pl. áramlásból adódó). A mérőeszköz felmelegedéséből származó hőveszteség.

Jelátalakító: optikai A biokatalitikus kölcsönhatás során UV-VIS abszorpció, bio- és kemilumineszcencia, fluoreszcencia, foszforeszcencia, visszaverődés, szóródás, stb. történik. Optikai szálak és lézerek fejlődésével nagyobb figyelmet kaptak Előnyei az elektrokémiai szenzorokkal szemben: Nincs szükség referencia elektródra; Nincs szükség közvetlen kapcsolatra a biokatalizátor és az optikai szál között; Biztonságosabbak; Stabilabbak működési szempontból.

Jelátalakító: optikai Az optikai szál egyik végén rögzített szelektív biokomponens, a szál másik végén gerjesztő és érzékelő egység együttese Jelátalakító: optikai Scheper et al. (1994): BIOOPTROD Glükóz, fruktóz, glükonolakton és szorbit Glükóz-fruktóz oxidáz komplex (Zymomonas mobilis) NADP+/NADPH koenzim redukcióját/oxidációját 450 nm-en történő fluoreszcencia detektálásával vizsgálták (gerjesztés 360 nm) Pl. fruktóz redukálódik szorbittá, NADP+ lesz, fluoreszcencia csökken

Jelátalakító: optikai Huang et al. (1991): kemilumineszcencia FIA, on-line glükóz, állati sejttenyészet Immobilizált glükóz oxidáz (GOD): Glükóz + O2 + H2O → Glükonsav + H2O2 Hidrogén-peroxid + luminol → 425 nm-en fényemisszió

Köszönöm a figyelmet! 