14. TÖMEGSPEKTROMETRIA 14.1. A tömegspektrometria alapjai 14.2. A tömegspektrometria műszerei 14.3. A tömegspektrometria alakalmazása
14.1. A tömegspektrometria alapjai Izolált, ionizált részecskék tömeg-töltés arányuk szerinti elválasztása Angolul: Mass Spectrometry (MS)
A tömegspektrométer fő részei:
Egyszeres fókuszálású tömegspektrométer
Egyszeres fókuszálású készülék: Az anyagot ionizálják, az ionokat először elektromos térben gyorsítják, majd mágneses térben elválasztják. A részecske tömege m, elektromos töltése e. U feszültséggel gyorsítjuk.
A kinetikus energia:
Homogén mágneses térbe kerül. (A mágneses indukció iránya merőleges a belépő töltés mozgásának irányára) Lorentz erő: e: az ion töltése (az elemi töltés egyszerese, kétszerese, stb.) v: az ion sebessége B: a mágneses indukció
B: merőleges a papír síkjára A mozgás irányára merőleges erő körmozgásra készteti az ionokat (centripetális erő). Jobb-kéz szabály: hüvelykujj az áram irányába a többi kinyújtott ujj a mágneses tér irányába. Tenyerünk így az erő irányába mutat. B: merőleges a papír síkjára
Töltött részecskék szétválása mágneses térben
Az ionizáció módszerei Gőzfázisú módszerek elektron ütközéses ionozáció kémiai ionizáció Deszorpciós módszerek szekunder ion tömegspektrometria bombázás gyors atomokkal MALDI Elektroporlasztásos ionizáció
Az ionizáció módszerei a) Elektronütközéses ionizáció (pozitív gyökion) (negatív gyökion) A pozitív gyökionok stabilabbak. A tömegspektrometria csaknem kizárólag pozitív ionok szétválasztásával foglalkozik.
Elektronütközéses ionizáció (electron impact, EI) Izzószál (termikus elektronemisszió) e- minta (gőz) M+ ion gyorsító rések 1.rés: taszító (+) 2. rés: vonzó (-) 3. rés vonzó (-----) anód ütköző e- en. 70keV
Fragmentáció Az ionok tovább bomlanak párhuzamos és konszekutív reakciókban
b) Kémiai ionizáció (CI): ez is EI, de a mintához nagy feleslegben (~ 0,5 Torr) reagens gázt (CH4, NH3, izobután) adnak Elsősorban a reagens gázok ionizálódnak, ezek ütköznek a vizsgálandó molekulákkal. Főleg MH+ ionok (molekulacsúcs) keletkeznek: a molekulacsúcs azonosítására szolgál.
Citronellol kémiai ionizációs tömegspektruma Reagensgáz: i-C4H10 EI, fragmentáció: i-C4H10 → i-C4H9+ CI: M + i-C4H9+ → MH+ + i-C4H8 (proton átadás) http://www.chem.unl.edu/dsmith/Chemical Ionization.pdf
Citronellol EI-vel és CI-vel kapott tömegspektruma
c) Szekunder ion tömegspektrometria (SIMS, Secondary Ion Mass Spectrometry) Szilárd mintát Ar+ ionokkal vagy O2+ ionokkal bombáznak. A felületről atomok és ionok lépnek ki. A felület vizsgálatára szolgáló módszer.
d) Bombázás gyors atomokkal (FAB, Fast Atomic Bombardment) Nem illékony mintákra alkalmas. A mintát feloldják (pl. glicerinben). Semleges atomokkal (Ar, Xe) bombázzák Biológiai, gyógyszeripari minták vizsgálata
The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules" John B. Fenn 1917- 2010 Koichi Tanaka 1959-
(biológiai makromolekulák ionjai gőzfázisban) A repülő elefánt (biológiai makromolekulák ionjai gőzfázisban)
e) MALDI = matrix-assisted laser desorption-ionisation (Tanaka) mátrix: aromás sav
f) Elektroporlasztásos ionizáció ESI = Electrospray Ionisation (Fenn) 3000 V
Detektor: elektronsokszorozó Katód az ionok detektálására érzékeny Nincs ablaka (nagy vákuumban van) http://huygensgcms.gsfc.nasa.gov
Felbontás: M a vizsgálat ion móltömege, M az éppen még felbontott két csúcs közötti tömegszámkülönbség Pl. 500-as felbontás esetén az 1000-es és az 1002-es tömegszámú csúcsot külön jelzi, az 1000-es és az 1001-es tömegszámú csúcs egybeolvad.
14.2. A tömegspektrometria műszerei Csoportosítás a tömeganalizátor szerint: Egyszeres fókuszálású tömegspektrométer Kettős fókuszálású tömegspektrométer Kvadrupol tömegspektrométer Repülési idő tömegspektrométer
a) Egyszeres fókuszálású tömegspektrométer
Spektrum: mágneses tér változtatásával vagy gyorsító feszültség változtatásával Felbontás: 100-tól néhány 1000-ig
b) Kettős fókuszálású tömegspektrométer Az ionok elválasztása két lépésben, elektromos térrel és mágneses térrel Felbontás: néhány tíz ezertől 100 ezerig
Kettős fókuszálású tömegspektrométer
c) Kvadrupol tömegspektrométer Négy elektród (párhuzamos fémrudak) Közöttük halad az ionsugár. Két-két szemben lévő elektród mindig azonos potenciálon van. A potenciálnak váltóáramú és egyenáramú komponense is van.
Kvadrupol tömegspektrométer
Az elektródok feszültsége az idő függvényében
Adott feszültség-amplitúdók esetén egy bizonyos tömegtartományba eső ionok oszcillálnak. Még mielőtt belezuhannának az egyik elektródba, megfordul a polaritás. Így az ionok végigjutnak a rudak közötti üregen és elérik a kilépő rést. Az eltérő m/e-vel rendelkező ionok egyre nagyobb amplitúdóval oszcillálnak, és belezuhannak valamelyik elektródba.
Előnyök: gyors (nem a mágneses teret változtatjuk) m/e lineárisan változik a térerősséggel Felbontás: max 3000
d) Repülési idő tömegspektrométer (TOF: Time Of Flight) Az iongyorsítóban a különböző tömegű (de azonos töltésű) ionok azonos energiára tesznek szert: A nagyobb tömegűek kisebb sebességűek, a kisebb tömegűek nagyobb sebességűek lesznek.
Repülési idő tömegspektrométer Felbontás: néhány száztól néhány százezerig
14.3. A tömegspektrometria alkalmazása a) Analitikai alkalmazás Szerves molekulák szerkezetvizsgálata Polimerek vizsgálata Proteomika: fehérjék vizsgálata
a) Analitikai alkalmazás Móltömegek meghatározása Gázkeverékek kvantitatív analízise Nyomelemzés Izotóp-arány mérés Elemanalízis Kromatográfiával kombinált tömegspektrometria (GC-MS, LC-MS)
Nagy pontosságú MW mérése (HPLC-(ESI)MS-TOF) http://www.chem.agilent.com/Library/posters/Public/ASMS_2011_TP_242.pdf
b) Szerves molekulák szerkezetvizsgálata A csúcsok típusai: Molekulacsúcs Fragmens csúcsok M+A++B Többszörös töltésű csúcsok Metastabil csúcsok (rövid élettartamú ionok)
Tiofén
n-bután
n-bután 1) molekulacsúcs m/e = 58-nál viszonylag kis intenzitású 2) m/e = 43-nál van a legvalószínűbb csúcs 58-43 = 15, tehát egy metil-csoport hasadt le, C3H7+ ionból származik 3) m/e = 59-nél kis csúcs, 13C illetve 2H természetes jelenléte miatt (szatelit csúcs) 4) m/e = 29 C2H5+ de C4H102+ is. 5) m/e = 25,5 51-es, 2-szeres töltésű ion.
c) polimerek vizsgálata Polisztirol analízise MALDI-TOF tömegspektrométerrel 20000-es molekulatömegű polisztirol Mátrix: 2-nitrofenil-oktiléter U. Bahr, Anal. Chem. 64, 2466 (1992)
d) fehérjék szerkezetvizsgálata 1. lépés: Fehérje bontása enzimmel peptidekre http://www.moffitt.org/
d) fehérjék szerkezetvizsgálata 2. lépés Fehérje bontásából előállított peptid spektruma (MS/MS)