1 OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA Fotodinamikus terápia (VT), szept Fotokróm anyagok (BP), szept Fluoreszcencia-mikroszkópia (VT), okt Festékpróbák az anyagtudományban (KM), okt Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (KM), okt. 19.

2 ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni) Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

3 Festékpróbák Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák

4 Reichardt’s dye

5 „charge transfer” festék C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, (1994)

6 A Reichardt-festék abszorpciós színképe 90 %-os (m/m) glicerin-víz elegyben (GW), ionos folyadékban (IL), acetonitrilben (ACN) és diklórmetánban (DCM). K.A. Fletcher, Green Chem. 3, (2001)

7 S0S0 = 810 nm Ph-O-Ph = 453 nm H 2 O S1S1 Oldószer polaritás

8 skála Az oldószer polaritását jellemzi.

9 Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől

10 Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban  + 78  C max = 568 nm - 78  C max = 513 nm

11 Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban  + 78  C max = 568 nm - 78  C max = 513 nm Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban  1 bar max = 547 nm 10 kbar max = 520 nm

12 Festékpróba CD-spektroszkópiai alkalmazása

13 Példa biológiai CD vizsgálatra: DNS vizsgálata akridin naranccsal AN Az AN interkalációs komplexet képez

14 AN – DNS rendszerek CD spektruma a hozzáadott DNS mennyiség függvényében D. Fornasiero, J. Phys. Chem. 85, 613 (1981) exciton felhasadás

15 A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

16 Fluoreszcens festékpróbák J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999

17 O N N N C 2 H 5 C 2 H 5 C 2 H 5 C 2 H 5 + ClO 4 - Oxazin 1

18 Oxazin 1 UV-látható abszorpciós spektruma

19 Oxazin1 + receptor

20

21 Spektrofluoriméterek -stacionárius - időfelbontásos (  F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)

Vázlat 22  Műszerek stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás  Statikus kioltás  dinamikus kioltás  oldószer polaritás / hőmérséklet / viszkozitás hatása  Lippert-egyenlet  vibrációs relaxáció  Oldószer relaxáció  kettős fluoreszcencia  feherjék fluoreszcenciája / triptofán FRET rotációs diffúzió (orientációs relaxáció)

23 Stacionárius

24 Időkorrelált egyfoton-számlálás

25 Fluoreszcencia lecsengési görbe

26 Statikus kioltás

27 Oxazin1 + receptor

28

29

30

31 Dinamikus kioltás

32 Lakowicz, p. 461

33 Lakowicz, p. 461

34 M + h M +  M + Q M*M*

35 A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval

36 Stern-Volmer egyenlet

37 Oldószer polaritása és hőmérséklete

38 S0S0 S1S1 Oldószer polaritás

39 S0S0 S1S1 vibrációs relaxáció s oldószer relaxáció oldószer relaxáció s abszorpció s emisszió s

40 Polaritás hatása: Lippert-egyenlet + _ a  G v.  E

41 Lippert-egyenlet + _ a  G v.  E

42 Naftilamin-származékok Stokes eltolódása Lakowicz, p. 191

43 Prodan Lakowicz, p. 200 Ikerionos gerjesztett állapot, spektrum eltolódás a polaritás függvényében

44 Patman C CH 3 (CH 2 ) 14 O CH N(CH 3 ) 3 + A Prodan lipofilizált + ionos változata

45 Lakowicz, p. 199

IFIF [nm] Lakowicz, p Oldószer relaxáció sebessége kisebb, ha csökken a hőm. - a sáv -30  C-on a legszélesebb: kettős fluoreszc.

47 Kettős fluoreszcencia DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201

48 Acrylodan N O H H H H 3 C CH 3 Hidrofób festék, zsírsav-megkötő fehérje vizsgálatára használják

49 Zsírsavkötő fehérje működésének vizsgálata Lakowicz, p. 202 FABP = fatty acid binding protein Titrálás zsírsavval (oleát)

50 Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán

51 Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, pH 7) Lakowicz, p. 446

52 Lakowicz p. 453 A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára 1)Apoazurin Pfl 2)T1 ribonuklease 3)staphillococcus nuclease 4)glucagon

53 Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

54 Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

55 Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r 6 -nal arányos

56 Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

57 Akceptor Donor: EtBr (etidium bromid)

58 EtBr abszorpció BODIPY fluoreszcencia

59 Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni

60

61 Festékmolekula orientációs relaxációja + _ a  G v.  E

62 Hidrodinamikai súrlódás járuléka Stokes-Einstein-Debye egyenlet

63 Dielektromos súrlódás járuléka

64 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága (  ) 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

65 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán