A λ bakteriofág +++

Kb db fág van a bioszférában Bakteriofágok vegetatív replikációs ciklusa

Mérsékelt bakteriofágok – lízis vagy lizogénia λ, P2, MuP1 N15 A tengervízben 10 9 db/ml fág is lehet Vegetatív ciklus

A λ fág lízis – lizogénia döntése a fejlődésgenetika legismertebb modellrendszere

A λ fág genetikai térképe Mozaikos, moduláris szerkezet – cserélhető modulok

Cserélhető modulok a λ fágban

A λ fág gének transzkripciója attL attR cos Profág Ragadós végeknél körré zárt Vegetatív fág kromoszóma kromoszóma attP cos

A λ fág genomja

A λ fág lízis – lizogénia döntése

- Korai transzkripció - Késleltetett korai transzkripció Génexpressziós kaszkád a vegetatív szaporodás során - Késői transzkripció N Q A génexpressziós kaszkád és a gének moduláris szerveződése lehetővé tesz alternatív fejlődési útvonalakat

Génexpressziós kaszkád a vegetatív szaporodás során Antiterminátor Represszor Integráció/ Excízió Antiterminátor (késői gének) Replikáció Regulátor (P I, P RE, P antiq ) { FtsH Proteáz inhibitor

Génexpressziós kaszkád a vegetatív szaporodás során (Lízis, fej, farok)

A λ fág lízis – lizogénia döntése

- Korai transzkripció - Késleltetett korai transzkripció A lizogéniához vezető eseménysorozat N Q CII - Átkapcsolás a lizogén útvonalra - Lizogénia fenntartása

A lizogéniához vezető eseménysorozat

Hogyan tartja fenn a CI regulátor a profág állapotot? CI három promótert szabályoz: pR – negatív pL – negatív pRM – pozitív és negatív korai promóterek CI affinitása az operátorokhoz: oR1 >oR2 > oR3 és oL1 > oL2 > oL3

A λ fág lízis – lizogénia döntése ?

CII DNS károsodás Tápanyag ellátottság Hőmérséklet λ/sejt InaktívAktív Lítikus út Lizogén út

A CII gén expressziójának szabályozása Transzkripció Transzláció Fehérje stabilitás

A gazdasejt környezetének hatása a λ fág lízis – lizogénia döntésére

A λ fág lízis – lizogénia döntése

A lizogénia → lízis kapcsoló ?

Genetikai kapcsoló -Két stabil állapot -A két állapot közötti átkapcsolás specifikus szignálok vagy random fluktuációk következménye lehet

A λ fág genetikai kapcsolója A λ fág esetében a spontán átkapcsolás átlagosan generációnként egyszer történik [CI] [Cro] DNS károsodás - SOS repair Alacsony szintű transzkripció A lizogénia kialakulására nincsen hatása!

Speciális transzdukció Tandem parciális diploid Hiányos fág genom – helper fág szükséges

A λ homológ rekombinációs (Red) rendszer elemei Exo5’→3’ dsDNS-függő exonukleáz csak a DNS végétől indul, nickek nem jók BetssDNS-t köt (>35 bp), megvédi az ssDNS nukleázoktól elősegíti a DNS szálak hibridizálását Az Exo fehérjével komplexet képez Dupla szálú DNS inváziójára nem képes, de egy rés (gap) már elég Gamgátolja a lineáris DNS-eket eltávolító rendszerek működését (RecBCD, SbcCD) nem gátolja a sejt saját rekombinációs funkcióit

- RecA kötődése a 3’ egyszálú túlnyúló véghez - Homológia keresés (ép DNS is jó) - Szálcsere Az élesztő DSB repair rendszerrel mutat hasonlóságot Alternatív rekombinációs útvonalak

Recombineering

DNS klónozás gap repair-rel. Két eljárást írtak le a nyitott (gap) plazmid „kijavítására” a fág rekombiniációs funkcióival. A színes szegmensek 5’ és 3’ végei 70-ntnyi, 5’ homológ primert jeleznek (sárga vagy piros) és a 3’ végek (nyilak): a plazmidot lineáris formában amplifikáljuk. (A)a target gén kinyerése a kromoszómából gap repair-rel a lineáris vektorral történő elektroporáció után. (B)(B) klónozás a lineáris vektor és a lineáris PCR-rel amplifikált DNS koelektroporációjával, ha mindkét DNS-nek homológ határoló szekvenciái vannak.

fág gazda attP attB Integrált profág integráció excizió Int IHF Int IHF Xis attL attR Helyspecifikus rekombináció

Konzervatív helyspecifikus rekombináció Konzervatív: pontos vágás és illesztés Helyspecifikus: meghatározott DNS szekvenciák között történik a szálcsere (specifikus DNS-fehérje kölcsönhatások) Hatékonysága elérheti a 100%-ot

Kromoszóma manipuláció I. Integráció Génbeviteli rendszerek -Nem minden baktérium transzformálható, viszont mérsékelt fágok izolálhatóak (10 30 baktérium és fág van a földön állítólag…) -Vannak széles gazdaspecifikusságú konjugatív vektorok (replikáció nem fontos) -Az integráció és excízió elválasztható

The Gateway ® Cloning System Your Application Gene1Gene2Gene3Gene4 Your Application Gene Protein Localization Gene Protein Purification Gene RNAi Gene Cell-Free Gene Protein interaction Gene Entry Clone PCR Gene synthesis ORF collection Library Your Source Irányított klónozás Leolvasási keret megmarad Nem kell restrikciós endonukleáz Nem kell ligáz 1 óra, szobah ő n >99%- os hatékonyság Nem kell újra szekvenálni Automatizálható Reverzibilis reakciók

A λ fág replikációja és a kromoszóma fág fejbe pakolása Komplementer ragadós végek (+DNS ligáz)

Fág klónozó vektorok: 1.In vitro módosított változatok (E. coli-t fertőzik). 2.A lineáris λ kromoszóma centrális régióját restrikciós enzimmel(ekkel) kivágjuk és emésztett DNS-t ligálunk a helyére. 3.DNA is packaged in phage heads to form virus particles. 4.A λ kromoszóma kér karja + az inzert (37-52 kbp) a megfertőzött E. coli sejtekben replikálódik. 5.A fágok az E. coli-t használva a lítikus útvonalon szaporodnak. 6.Így a klónozott DNS nagy mennyiségben előállítható. 7.Itt is, mint a plazmid vektoroknál sok restrikciós hely lehetséges; nagyobb DNS fragmentumok klónozása. 8.Toxikus gén (termék) sem probléma. A sejt így is úgy is elpusztul.

Cosmid klónozó vektorok: 1.Plazmid és fág vektor tulajdonságok is. 2.Csak mesterséges lehet; gyűrűs. 3.E. coli replikációs origó (ori) szekvencia. 4.Szelektálhtó marker, pl. amp R, kan R 5.Restrikciós hasító helyek. 6.A fág cos helye teszi lehetővé az in vitro pakolást. Ezután fertőzik a sejteket és a cosmid plazmidként replikálódik. 7.Cosmid+inzert kbp.

Rekombináns DNS könyvtárak (3 típus): 1.Genom könyvtár: Restrikciós enzimmel emésztett, klónozott genomi DNS fragmentumok olyan gyűjteménye, amelyikben az adott élőlény genomjának minden egyes szekvenciája legalább egy példányban megvan. 2.Kromoszóma könyvtár: Egy-egy kromoszóma klónozott fragmentumainak gyűjteménye. 3.Komplementer DNS (cDNS) könyvtár: A sejtekből izolált mRNS- ekről másolt DNS klónok gyűjteménye. Reverz transzkriptáz (RNS függő DNS polimeráz) RNS templátról szintetizál DNS-t A cDNS könyvtárak a sejtekben megnyilvánuló géneket tükrözik. A klónok száma egy teljes könyvtárhoz kiszámítható a genom méretéből és az átfedő restrikciós fragmentumok átlagos nagyságából. A könyvtárnak sokkal több klónt kell tartalmaznia, mint a kiszámított szükséges minimális klón szám.

Vektorok manipulációja Plazmidok, fágok, vírusok Phage display