Az immunizálás és a vakcináció (ÁOK) Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 6-7. fejezet. Buzás Edit, Holub Marianna

I. Immunizálás Immunválasz kiváltása egy adott szervezetben antigén bevitelével

Az immunizálás célja poliklonális ellenanyag létrehozása (pl. birka vvt ellen) monoklonális antitestet termelő hibridóma előállítására betegségmodellek indukciója vakcina fejlesztés (preklinikai /állatkísérletes) fázisa

Egy antigénen általában több epitóp (antigéndetermináns van) Globuláris proteinek 4

Neoepitóp (proteolízissel keletkezik) Epitóp változatok Konformációs epitóp Neoepitóp (proteolízissel keletkezik) Lináris epitóp hozzáférhető epitóp nem hozzáférhető epitóp Hiányzó determináns denaturáció A limitált proteolízis helye denaturáció denaturáció Neoepitóp az Ig mind a natív, mind a denaturált fehérjével reagál az Ig csak a denaturált fehérjével reagál Az epitóp elvész denaturáció során a proteolízis helyéhez közeli epitóp 5

Ismétlés: A komplex antigén poliklonális immunválaszt vált ki, ami eltérő specificitású ellenanyagok termelődéséhez vezet 6

Ismétlés: Poliklonális ellenanyagok előállítása olyan kis molekula, mely csak valamely nagyobb karrier molekulához kötve vált ki immunválaszt (pl. DNP, hisztamin, tesztoszteron) Mi a Haptén? 7 7

Immunizálás hibridóma + 8

Intraperitoneális oltás Intradermális oltás Intraperitoneális oltás Intramuszkularis oltás 9

Mi történik, ha a testidegen fehérjét intravénásan adjuk be immunizálás céljából? Az antigén kihígul az érpályában Enzimatikusan lebomlik egy idő után Ha sejtek fel is veszik endocitózissal és processzálás után prezentálódik is MHC-vel kostimuláció nélkül anergia nagyon kicsi a valószínűsége, hogy találkozik olyan recirkuláló T vagy B sejttel, melynek receptora specifikus az adott antigénre

Mi történik, ha szubkután oltunk szolubilis antigént? az antigén szétdiffundál a bőr alatti kötőszövetben enzimatikusan lebomlik egy idő után a szöveti sejtek felvehetik és akár prezentálhatják is MHC-vel kostimuláció nélkül: anergia nagyon kicsi a valószínűsége, hogy találkozik olyan recirkuláló T vagy B sejttel, melynek receptora specifikus az adott antigénre 11

Mi lehet a megoldás? Mit célszerű együtt oltani az antigénnel annak érdekében, hogy legyen kostimuláció? Az antigénnel együtt danger signált (pl. PAMP-ot) tartalmazó adjuvánst is oltunk. Adjuváns (hatásfokozó szer): mely elősegíti egy adott antigénnel szembeni immunválasz kialakulását kostimulációs hatást biztosítva. Az adjuvánsok valamely danger receptoron (pathogen recognition receptor, PRR) keresztül hatnak 12

ISCOM (Immune stimulating complex) Adjuvánsok pl. Freund Liposome: mesterségesen létrehozott, lipid kettősréteggel határolt vezikula. Microsphere: kis, gömb alakú partikula (1μm-1mm) W/O or O/W emulsion: Whether an emulsion turns into a water-in-oil emulsion or an oil-in-water emulsion depends on the volume fraction of both phases and on the type of on the type of emulsifier. PRR? Pathogen recognition receptor TLR: Toll like receptor ISCOM (Immune stimulating complex)  40 nm átmérőjű képletek, melyek spontán keletkeznek, amennyiben koleszterin, foszfolipideket és szaponinokat megfelelő arányban keverünk össze 13

14

Szubkután oltás: antigén + adjuváns Mi tehetünk annak érdekében, hogy növeljük a specifikus receptorral rendelkező limfocitával való találkozás esélyét Az antigén lassú felszabadulását eredményező adjuváns alkalmazása (pl. stabil emulzió) Szubkután oltás: antigén + adjuváns Gombostűfej -> lencse 9 nap múlva regionális nyirokcsomókban sok antigén-specifikus T sejt 15

A nyirokcsomókban T sejt aktiváció, proliferáció és differenciáció zajlik DC DC DC

Mi az oka, hogy egy adott fehérje antigénnel szembeni T sejt válasz egy vagy néhány epitóp (az un. immunodomináns régió) ellen irányul csak? Az MHC molekulák kötőhelyeiért folytatott affinitás alapú verseny győztese (az ábrán piros színnel jelzett peptid) foglalja el az MHC molekulák többségének peptidkötő helyét immundomináns epitóp

Intraperitoneális oltás: antigén + adjuváns Egy-két hét alatt a lépben az antigénspecifikus B sejtek/plazmasejtek száma megnő, a szérumban antigénspecifikus antitestválasz mérhető 18

Immune Epitope Database http://www.immuneepitope.org/ 19

Per os Kialakul-e immunválasz, ha a testidegen fehérjét per os visszük be (pl. gyomorszonda segítségével)? Általában orális tolerancia alakul ki a per os bejutó antigénekkel szemben (toleráljuk a táplálékfehérjéket illetőleg az normál bélflóra fehérjéit) 21

Van-e jelentősége az antigén dózisának az immunizálás során? Igen „High dose” tolerancia (anergia és deléció) „Low dose” tolerancia (Treg aktiváció) Nature Reviews Immunology 4, 407-419 (June 2004)

Van-e jelentősége az antigén dózisának az immunizálás során? Az immunizálás tanulságai az emberi vakcinák előállításának alapját képezik 

II. VAKCINÁCIÓ -tumorsejtek elleni válasz elősegítése -kórokozók elleni válasz elősegítése Immunstimuláció

IMMUNSTIMULÁCIÓ CÉLJA terápia:  hagyományos gyógyszeres (antibiotikumok, vírus anyagcsere gátlók)  passzív immunizálás (ellenanyagok, sejtek) PREVENCIÓ:  gyógyszer  aktív vakcinálás: - a specifikus felismerő készlet arányának növelése - specifikus immunológiai memória létrehozása

T-dependens antigének: ált. fehérjék T-Independens antigének: ált. poliszacharidok T-B kooperáció Csak B-sejt aktiválódik Nagy affinitású antitestek, memória Rövid távú memória EPITÓPOK Epitóp Protektív epitóp Amit a TCR/BCR felismer Nagyon specifikus, az adott patogénre egyedi molekuláris felszín T-független: Pl. LPS Neutralizáló antitest: gátolja a patogén elterjedését

A neutralizáló antigén a protektív epitóphoz kötődik.

Pl. 14 napon belül HepA ellen Antigénspecifikus immunstimuláció = Aktív immunizálás Eredmény: plazmasejtek: ellenanyag termelés + effektor T sejtek memória válasz   A passzív immunizálást biztosító specifikus hiperimmun gamma-globulint Magyarországon elszenvedett veszettség-fertôzés gyanús expozíció alkalmával csak az immunrendszer hibás működése esetén ajánlott beadni. Magyarországon 1949 óta egyetlen emberi veszettség eset sem fordult elô az általános gyakorlat szerint kizárólag aktív védôoltásban részesítettek között, ezért a veszettség elleni humán immunglobulin, vagy veszettség elleni immunszérum (állati savó) alkalmazása nem elôírt. http://www.medlist.com/HIPPOCRATES/II/4/232.htm Pl. veszettség elleni oltás Pl. tumorvakcinák Pl. 14 napon belül HepA ellen

AKTÍV VAKCINÁCIÓ PASSZÍV VAKCINÁCIÓ Legyengített, elölt teljes kórokozó, vagy kórokozó alegység Antitestek, T-sejtek és memóriasejtek kialakulása : ADAPTÍV Immunválasz 7-14 nap látencia Fertőzéskor memóriasejtek aktiválódása, differenciálódása effektorsejtté Antitest Nincs adaptív immunválasz: nem alakul ki antitest, T-sejt repertoir Azonnali hatás: neutralizáció/ opszonizáció/ komplement aktiválás: (TERMÉSZETES IMMUNVÁLASZ) Nincs memória

A hatékony aktív oltóanyag tulajdonságai biztonságos protektív Hosszú távú védelem Serkenti a neutralizáló antitesteket Serkenti a protektív T-sejteket Gyakorlati szempontok Nem okozhat betegséget v. halált Élő kórokozó által előidézett betegséggel szemben véd Évekig tartó védettséget ad Bizonyos kórokozók (pl. poliovírus) olyan sejteket fertőznek (pl. neuronok), amelyek nem pótolhatók. Neutralizáló antitest megelőzi ezeknek a sejteknek a megfertőződését Bizonyos kórokozók (pl. intracellulárisok) sejt-mediálta immunválasszal hatékonyabban eliminálódnak Biológiai stabilitás, könnyű bevitel, kevés mellékhatás, olcsó előállítás

Gyorsabb, erősebb hatású Elsődleges Másodlagos Immunizálás után 5-10 nap 1-3 nap Válasz amplitúdó kisebb nagyobb Antitest izotípus IgMIgG Több IgG (bizonyos esetekben IgA, IgE) Antitest affinitás Kisebb átlag affinitás, nagyobb variabilitás Nagyobb átlag affinitás (affinitás érés)

A hatékony oltóanyag tulajdonságai biztonságos Nem okozhat betegséget v. halált protektív Élő kórokozó által előidézett betegséggel szemben véd Hosszú távú védelem Évekig tartó védettséget ad Serkenti a neutralizáló antitesteket Bizonyos kórokozók (pl. poliovírus) olyan sejteket fertőz (pl. neuronok), amelyek nem pótolhatók. Neutralizáló antitest megelőzi ezeknek a sejteknek a megfertőződését Serkenti a protektív T-sejteket Bizonyos kórokozók (pl. intracellulárisok) sejt-mediálta immunválasszal hatékonyabban eliminálódnak Gyakorlati szempontok Biológiai stabilitás, könnyű bevitel, kevés mellékhatás, olcsó előállítás

Ezt akarjuk elérni! Activities against infected cells. These activities can be mediated by both neutralizing and non-neutralizing antibodies. Neutralizing antibodies bind to the same proteins on infected cells as on free virus. Non-neutralizing antibodies bind to viral proteins that are expressed on infected cells but not, to a significant degree, on free virus particles. Examples include altered forms of Env protein and certain non-structural (NS) proteins, such as NS1 of dengue virus. The binding of neutralizing and/or non-neutralizing antibodies to infected cells can lead to clearance of such cells or the inhibiton of virus propagation as shown. Nature Reviews Immunology 2, 706-713 (September 2002)

A hatékony oltóanyag tulajdonságai biztonságos Nem okozhat betegséget v. halált protektív Élő kórokozó által előidézett betegséggel szemben véd Hosszú távú védelem Évekig tartó védettséget ad Serkenti a neutralizáló antitesteket Bizonyos kórokozók (pl. poliovírus) olyan sejteket fertőz (pl. neuronok), amelyek nem pótolhatók. Neutralizáló antitest megelőzi ezeknek a sejteknek a megfertőződését Serkenti a protektív T-sejteket Bizonyos kórokozók (pl. intracellulárisok) sejt-mediálta immunválasszal hatékonyabban eliminálódnak Gyakorlati szempontok Biológiai stabilitás, könnyű bevitel, kevés mellékhatás, olcsó előállítás

CD8+ és CD4+ T-sejtes antivirális válasz. Th1 serkenti a celluláris iv.-t

CD8+ T- sejtválasz az infekcióra. CD62L: L-szelektin (leu) CD127: Il-7R (ly progen) Nature Reviews Immunology 8, 107-119 (February 2008)

Elsődleges – másodlagos CD8+ T- sejtmemória kinetikája LOD, limit of detection Emlékeztető oltás Másodlagos immunválaszban kialakuló memóriasejtek: Gyorsabban aktivizálódnak, nagyobb számban jönnek létre, Önmegújító képességük az évek alatt kialakuló hosszútávú memória kialakulásakor nagyobb arányú (IL-2-term.)

Az oltási naptárban az egy oltásra vonatkozó megadott intervallumokat minimumként kell felfogni, amelyek nem csökkenthetők, de meghosszabbításuk általában nem zavarja a kellő immunválasz kialakulását.

Bejutattatás módja Injekció Intradermálisan, szubkután, intramuszkulárisan Mucosan át: orális, nazális

Szövet specifikusan migráló memóriasejtek Mucosális vakcináció értelme: Ugyanarra az antigénre adott immunválasz függ a mikrokörnyezettől Subcután, intramusculárisan: nyirokcsomó immunválasz Orálisan, nasálisan: Mucosa immunválasz Luminális barrierek mentén: Nem processzált antigének pl. transzcitózis M-sejtekkel a barriereket penetráló antigéneket kiszűri DC termelte IL-12 hatására Th1: IFN-gamma and IL-2 IgG: komplement aktiválás TGF beta-1 hatására Treg + Th2, IgA: Virulencia faktorok, adhézió blokkolása, neutralizálás protect the parenchymal organs and peripheral anatomic sites bathed in tissue fluid and supplied by the blood microvasculature. 75 percent of the antibody-producing cells in the body make IgA, and most of this IgA is released continuously into gastrointestinal fluid, saliva, tears, urine and other secretions. Up to 40 mg/Kg body weight of IgA is manufactured and secreted daily in humans, which is many orders of magnitude greater than that of all other immunoglobulin isotypes Peripheral and Mucosal Immunity: Critical Issues for Oral Vaccine Design Arthur O. Anderson The mechanisms of oral tolerance remain unclear. Tolerance could be primed in Peyer's patches or in the intraepithelial compartment. I think IEL are good candidates for communicating a toleragenic signal. Epithelial cells can present antigens; but, without important costimulatory molecules, the cells that see this antigen may die or be rendered non-responsive (Matzinger, 1994). It is thought that tolerance can occur through active suppression (cells or cytokines that induce non-responsiveness), anergy (live, non-responsive cells), or apoptosis (signal programs cell death) of antigen-reactive cells. Somehow the tissue is able to distinguish pathogens (dangerous) from normal flora (safe) and food antigens (safe) (Matzinger, 1994). Inducible chemokines may be the mucosal "danger" signal  Pathogens that bind and/or invade mucosal epithelium cause epithelial cells to release cytokines and chemokines that attract inflammatory and/or immune cells, or cause epithelial cells to express proteins (classical and non-classical MHC) that target antigens for induction of immunity (Eckmann et al., 1993; Agace et al., 1993; and McCormick et al., 1993). Mucosal antigens that lack costimulatory activity are programmed for tolerance (Kagnoff, 1996; Bendelac, 1995). When tolerance results from mucosal immunization, it does not appear to diminish the stimulation of B cells committed to IgA secretion, however. Mucosal tolerance (Mowat, 1994) is most likely responsible for preventing systemic responses to common food antigens, but it has different conditions of triggering than that for cross regulation. Immunol Rev. 2005 Aug;206:232-59. Oral tolerance. Szövet specifikusan migráló memóriasejtek A vérrel/ szövetnedvekkel terjedő mikroorganizmusok ellen véd: pl. HepB Luminális barrierek mentén terjedő mikroorganizmusok ellen véd:pl. polio vírus

ÉLETKORI KÜLÖNBSÉGEK A B-SEJTVÁLASZBAN naiv memória életkor naiv memória csecsemő Surviving to old age requires a successful response to a wide range of potential pathogens and the generation of a prodigious ‘reservoir’ of immunological memory. Antibody responses to viruses, such as varicella-zoster, measles and mumps, have half-lives of 50 years or more, whereas antibody responses to non-replicating protein antigens, such as tetanus and diphtheria toxins, decline with half-lives of 10–20 years68. This suggests that the persistence of antigen contributes to the continued production of antibody, as indicated by studies in mice69. both extremes of life are linked by an inability to respond to new antigens, albeit for mechanistically different reasons idős Pl. HiB, rotavirus , Salmonella ellen Pl. Infuenza ellen Mindkét életkorban gyenge immunválasz jön létre az új antigének ellen, de más-más ok miatt

A vakcináció hatásossága korlátozott a két szélsőséges életkorban Gyengébb, rövidebb ideig tartó immunválasz pl. HiB, rotavirus , Salmonella A plazma-sejtek kialakulá-sához szükséges feltételek korlátozot-tak Az IgG antitestek száma csökken: új patogének és már egyszer immunválaszt indukált patogének ellen is. Nature Reviews Immunology 9, 185-194 (March 2009)

Kevésbé aktiválódó B-sejt  Kevesebb plazmasejt Korai Gyerekkorban: Kevés marginális zóna B-sejt Kevésbé aktiválódó B-sejt  Kevesebb plazmasejt Nature Reviews Immunology 9, 185-194 (March 2009)

Rövid életű plazmasejtek Korai Gyerekkorban: Erősebb memóriasejtté differenciálódás Éretlen FDC kis hatékonyságú kostimuláció Rövid életű plazmasejtek Nature Reviews Immunology 9, 185-194 (March 2009)

Oltási stratégiák csecsemők és idősek esetén Adjuvánsok optimalizálása A naiv B-sejt aktiváció serkentése: pl. Hib A naív B-sejtek másodlagos nyirokszervekbe vándorlásának serkentése depo vakcinákkal : pl. Fluval-P (H1N1) Antigéndózis emelése A B-sejt aktiváció növelése, több germinális centrum kialakulásának elősegítése: pl. Fluval-P Outbreaks of serious infection due to type b H influenzae can be prevented by vaccination or prophylactic therapy. Initial trials of vaccination with type b H influenzae PRP were disappointing, because this polysaccharide in its pure form is not immunogenic in infants, the group most at risk of infection. Later studies showed that injection of PRP conjugated to a protein, such as diphtheria toxoid, that serves as an adjuvant results in good antibody responses in infants. Clinical trials with these vaccines have been successful, and preparation of PRP linked to outer membrane proteins or ribosomes are currently in widespread use. Többszöri oltás és többszöri emlékeztető oltás A naiv B-sejtek másodlagos nyirokszervekbe vándorlásának serkentése ; A memóriasejtek kialakulásának és fennmaradásának elősegítése: pl. Fluval-P

A vakcinák típusai Egész (teljes) vakcinák: élő, attenuált Inaktivált élő, rekombináns Alegység vakcina: protein szintetikus peptid DNS (RNS)

Engedélyezett monovalens pandémiás influenza oltóanyagok a 2009-2010-es influenza szezonra Inaktivált (elölt) vírusokat tartalmazó teljes vírusvakcinák Detergens kezeléssel feldarabolt, inaktivált vírus részecskéket tartalmazó hasított (split) vírusvakcinák. Tisztított hemagglutinint és neuraminidázt tartalmazó subunit (felszíni antigén) vakcinák, amelyekből a többi vírus komponenst eltávolították (inaktivált). Élő, legyengített (cold-adapted) vírus vakcinák, melyek gyengített (nem patogén) teljes vírust tartalmaznak Baxter (EMEA), Omninvest + Al-foszfát adjuváns (Hungary), Cantacuzino (Románia) 8 gyártó Kínában, CSL (Ausztrália, USA) Sanofi Pasteur (US), Green Cross (Korea), GSK+ASO3 adjuváns (EMEA, Kanada) Novartis (USA) Novartis + M59 adjuváns (EMEA) Medimmune (USA) Microgen (Russia) Forrás: WHO 48

VAKCINAFEJLESZTÉS IRÁNYAI Jelenlegi vakcinák tökéletesítése Új vakcinák fejlesztése Empirikus módszerek  biotechnológiai vakcinafejlesztés

Mi a toxoid? Pl. alegység konjugátum vakcina esetén: Pl. Haemophilus influenzae B: T sejt-független (TI) B sejt válasz (poliszaharid a baktérium felszínén) diftéria toxoid protein + poliszaharid konjugátum - Diftéria toxoidra specifikus T sejtek citokineket termelnek – hatékony T sejtektől függő (TD) B sejt válasz 2 éves kor alatt is a bakteriális poliszaharid ellen Mi a toxoid?

VAKCINAFEJLESZTÉS IRÁNYAI Jelenlegi vakcinák tökéletesítése Empirikus módszerek  biotechnológiai vakcinafejlesztés Új vakcinák fejlesztése

Alegység vakcina: : csak epitóp - első lépés: a legjobb epitópok meghatározása (1 - 20) - második lépés : rekombináns DNS módszerrel a fehérje különböző epitópokkal való termeltetése baktériumokban Rekombináns protein vakcina  pl. humán papillomavírus elleni (HPV) http://www-scf.usc.edu/~uscience/gardasil_vaccine.html

növényekben történő expresszióval A patogén mikroorganizmus jellemző részletét expresszáltatják legtöbbször élesztőkben, ilyen például a Hepatitis B elleni vakcina növényekben történő expresszióval akár szájon át adható, „ehető vakcinát” is elő lehet előállítani A recombinant vaccine, hepatitis B vaccine involves insertion of the HBsAg gene using plasmids into yeast or mammalian cells; anyone with a life-threatening allergy to Baker’s yeast should not receive the vaccine.

VAKCINAFEJLESZTÉS IRÁNYAI Jelenlegi vakcinák tökéletesítése Empirikus módszerek  biotechnológiai vakcinafejlesztés Új vakcinák fejlesztése

Az új generációs vakcinák fejlesztésénél célzott fokozott immunogenitás alapja a megfelelő epitóp kiválasztása CÉL: Az „epitóp enhancement”: a peptid- MHC kötődés affinitásának növelése, Az MHCII-hoz horgonyzó aminosavak javítása,

B és helper T sejteknek ugyanazon molekuláris komplexben levő epitópokat kell felismerniük Figure 9-3 Szintetikus peptid vakcinák : Szintetikus T-és B- sejt epitópok képezik a vakcina alapját

A vakcinák előállítása „Reverz vakcinológia”- in silico vakcinológia A patogén ismertté vált genomjából indul ki A genomiális szekvencia bioinformatikai elemzése után kerül sor a kiválasztott szekvencia megklónozására és expresszáltatására Immunogenitási tesztek követik Hagyományos stratégia: Laboratóriumban szaporítják, majd egyenként izolálják azokat az antigén komponenseket, melyek a vakcina fejlesztés alapjául szolgálnak Gyakran szükség van az antigén klónozására

1. lépés: T sejt epitópok meghatározása: Pl. HLA-B53 véd a malária ellen: a bemutatott peptidben 2. helyen prolin maláriára jellemző, a 2. helyen prolin tartalmú peptid azonosítás 2. lépés: szintetizálás Tesztelés: köt-e a HLA-B53-hoz. Stimulálja-e a T sejteket? Ha igen: T-sejt proliferáció Peptid -> terápia

peptid-MHC komplex kötődés affinitásának növelése A vakcina hatékonyságának fokozása az aminósav szekvencia módosításával TCR Nem HLA-B53 MHC peptid-MHC komplex kötődés affinitásának növelése

A vakcina hatékonyságának fokozása a szekvencia módosításával peptid-MHC komplex TCR-hez kötődés affinitásának növelése TCR TCR MHC MHC kis és nagy affinitású T sejtek aktiválása TCR keresztreaktivitás növelése: peptid kiméra – különböző vírus törzsek felismerése repertoár torzulás (tumor epitópot felimerő T sejtek számának növelése)

és a megfelelő adjuváns Az új generációs vakcinák fejlesztésénél célzott fokozott immunogenitás alapja a megfelelő epitóp és a megfelelő adjuváns kiválasztása

Dendritikus sejtek mint vakcina hordozók (ex vivo) Immunizálás dendritikus sejtek segítségével – a jövő Dendritikus sejtek mint vakcina hordozók (ex vivo) sejttenyésztés, differenciáltatás

Néhány betegség, ami ellen még nincs hatékony vakcina Becsült éves előfordulás Kísérleti vakcinatípus Parazita: Malária 300-500 millió elölt kórokozó, alegység vakcinák, szintetikus peptid vakcinák, nukleinsav vakcinák Parazita: Sisztoszomiázis Nincs adat (éves becsült haláleset 14 000) alegység vakcinák, nukleinsav vakcinák Baktérium: Tuberkulózis (gyengülő hatékonyságú eredeti oltóanyag) 8 millió élő, legyengített kórokozó, szintetikus peptid vakcinák, nukleinsav vakcinák Vírus: HIV/AIDS 2 millió szintetikus peptid vakcinák, nukleinsav vakcinák data for 1999 from World Health Report 2000 (World Health Organization).

ismételt oltást kell adnunk Ellenőrző kérdés: Mi a teendő, ha antigénspecifikus IgG antitesteket szeretnénk nyerni immunizálással? Alacsony affinitású IgM Nagy affinitású IgG ismételt oltást kell adnunk