Fejezetek a sejtbiológiából Teloméra és telomeráz. Sejtmagvacska 2011. 11. 28. Dr. Tóth Sára SE Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet

Telomérák kimutatása in situ hibridizációval

A teloméra ismétlődő (repetitív) szekvenciákban gazdag Teloméra ~ 30 repeat Szubtelomerikus régió ~ 2000 repeat

Egészséges szomatikus sejtekben a telomérák osztódásról osztódásra rövidülnek

De vannak kivételek: csírasejtek és tumorsejtek

S fázis (DNS szintézis) 2 replikációs villa primáz  RNS primer DNA polimeráz 5’ 3’ monomerek: dezoxinukleozid trifoszfátok leading (vezető) és lagging (elmaradó) szál primer kivágása ligáz szemi-konzervatív Azonos DNS molekulák

A telomeráz RNS dependens DNS szintézist végez; reverz transzkriptáz

A telomeráz fő részei a TERT = az enzim, és a TERC = az RNS templátot tartalmazza a TERT felépítése

A telomérák sajátos szerveződésű és szerkezetű DNS-t tartalmaznak G-gazdag Visszahurkolódó Shelterin komplex jellemzi („sapkázás)

A teloméra térszerkezete G-kvadruplex

A visszahurkolódás korlátozza a telomeráz telomérához való hozzáférését

és a komponensek hibái által okozott betegségek A teloméra szerkezete és a komponensek hibái által okozott betegségek

A telomérahossz telomeráz általi fenntartása

Bizonyos tumorokat (telomeráz negatívak) alternatív teloméra hosszabítás (ALT) jellemez, amely homológ rekombináción alapul

az alternatív teloméra hosszabbítás PML body A PML testecske egyik lehetséges funkciója az alternatív teloméra hosszabbítás

A telomérák és a hisztonmódosulások – kromatinszerkezet kapcsolata AcH4 = acetilált H4 hiszton; AcH3 = acetilált H3 hiszton; 5metC = DNS metilált citozinja; H3K9me = H3 hiszton metilált 9. lizinnel; H4K20me = H4 hiszton metilált 20. lizinnel; HP1 = heterokromatin protein 1; TRF = TERF = telomeráz repeat-kötő faktor; RB = retinoblasztoma proteinek; DNMT = DNS metil-transzferáz; SUV = Hiszton metil-transzferáz

A telomérák és a hisztonmódosulások – kromatinszerkezet kapcsolata AcH4 = acetilált H4 hiszton; AcH3 = acetilált H3 hiszton; 5metC = DNS metilált citozinja; H3K9me = H3 hiszton metilált 9. lizinnel; H4K20me = H4 hiszton metilált 20. lizinnel; HP1 = heterokromatin protein 1; TRF = TERF = telomeráz repeat-kötő faktor; HMT = hiszton metil-transzferáz; RB = retinoblasztoma proteinek; DNMT = DNS metil-transzferáz

A telomérák és a hisztonmódosulások – kromatinszerkezet kapcsolata AcH4 = acetilált H4 hiszton; AcH3 = acetilált H3 hiszton; 5metC = DNS metilált citozinja; H3K9me = H3 hiszton metilált 9. lizinnel; H4K20me = H4 hiszton metilált 20. lizinnel; HP1 = heterokromatin protein 1; TRF = TERF = telomeráz repeat-kötő faktor

Az emlős telomérák és szubtelomerikus régiók epigenetikus módosulásai Epigenetikus jelenségek: a DNS szekvenciát nem érintő, de expresszióját befolyásoló jelenségek pl. DNS metiláció, hiszton módosulások, kromatin remodellezés

A nem jól működő, illetve rövid telomérák feltételezett szerepe az emberi betegségekben

A rövid telomérákkal kapcsolatos - a csontvelő működés zavarával járó - kórképek

A teloméra rövidülés az öregedés és a rák kapcsolata

Az öregedés, a rák és a telomérák kapcsolata

Werner-szindróma

A Werner-szindrómára jellemző sejtfenotípus megfordítható telomeráz expresszáltatásával A TERT-tel (telomeráz) transzformált dermális fibroblasztok folyamatosan osztódnak, míg a Werner szindrómás sejtek általában 20 osztódást követően leállnak az osztódással.

Teloméra rövidülést gyorsító tényezők Sterssz Dohányzás Kövérség Korai öregedéssel járó kórképek Ataxia telangiectasia (ATM) Werner szindróma (WR) Bloom szindróma (BLM) Dyskeratosis congenita (KC1, TERC) Aplasztikus anémia (TERC, TERT) Fanconi anémia (Fans gének) Nijmegen kromoszómatörési szindróma (NBN)

Daganat- és áttétképzés kapcsolata a teloméra rövidüléssel

Terápiás lehetőségek Telomeráz gátlás Aktív immunterápia Telomérát roncsoló ágensek Szuicid génterápia Telomeráz expressziót vagy biogenezist gátló szerek

Terápiás lehetőségek I.

Terápiás lehetőségek II.

Egyéb sejtmag alkotók: sejtmagvacska

A sejtmagvacska részei NO = nukleolusz organizátor = FC = fibrilláris centrum PG = pars granulosa = GK = granuláris kompartment PF = pars fibrosa = DFK= denz fibrilláris kompartment NAC = nukleolusz asszociált kromatin

Nucleolar organizer region = NOR = nukleolusz organizátor régió: Ismétlődő rDNS szekvenciákból áll

Kétéltű oocyta lámpakefe kromoszómái Génamplifikáció  rDNS sokszorozódás  sok rRNS

A sejtciklus során a sejtmagvacskát érintő változások szétesés fúzió

Sejtmagvacska fúzió

A riboszóma keletkezés kinetikája és az rRNS splicingja

rRNS szintézis a sejtmagvacskában

A sejtmagvacskában zajló folyamatok rRNS szintézis rRNS érés (splicing) riboszóma alegység összeszerelés snoRNA= small nucleolar RNA

A riboszómák keletkezése és funkciója  = módosult DNS-bázis DNS-bázis

A prokaryota és eukaryota riboszómák összehasonlítása

A sejtmagvacska és a mitózis NDF = nucleolar derived foci; PNB = prenucleolar body; PR= perichromosomal region A sejtmagvacska és a mitózis

A sejtmagvacska fehérjéinek funkcionális megoszlása emberi növényi

Riboszóma alegységek összeszerelődése

Riboszóma alegységek összeszerelődése II. Biogenesis of ribosomes represents a highly dynamic process which is precisely coordinated in a temporal and spatial fashion. More than 150 non-ribosomal factors and approximately 70 ribosomal proteins as well as several RNAs participate in this process. Formation of heterodimeric Noc-proteins is essential for assembly, maturation and transport of both ribosomal subunits. We investigate how generation and dynamics of pre-ribosomes are controlled through the formation of different Noc-complexes. Furthermore we are analysing how the communication between maturation of ribosomes, rDNA transcription and the cell cycle occurs.  

Az rRNS érésében szerepe van a snoRNS-ek által irányított bázismódosításoknak (uridin–pszeudouridin csere és metiláció) is All ribosomal RNAs, with the exception of the 5S, are transcribed as a polycistronic transcript known as pre-ribosomal RNA (pre-rRNA or 45S) in the nucleolus. Transcription of rDNA is dependent on three basal transcription factors: the 'selectivity complex' (SL1 or TIF-IB), the HMG1 box architectural upstream binding factor (UBF) and the DNA-dependent RNA polymerase I (Pol I). Both UBF and SL1 make direct contacts with a 150-bp region of DNA in the rRNA gene promoter, which contains two sequence elements known as the upstream control element (UCE) and the core. In the case of UBF, it probably binds to these promoter elements as a dimer. UBF is thought to bind the promoter first, enabling subsequent recruitment of SL1 and Pol I. The initiation factor TIF-IA is also part of this complex. Concomitant with rRNA transcription, the rRNA sequences are extensively modified. Specifically, a large family of small nucleolar RNAs (snoRNAs) guides the site-specific conversion of uridine to pseudouridine ( ) in rRNA. This is accomplished through direct base-pairing of snoRNAs with specific rRNA sequences, leaving a single uridine exposed to the enzymatic activity of dyskerin, the pseudouridine synthase that mediates the modification of this residue. In addition, other snoRNAs also guide the formation of 2'-0-methylated nucleosides (-CH3) in rRNA. The pre-rRNA precursor is then cleaved at specific sites by RNases to produce a series of characteristic intermediates (41S), and finally mature rRNAs — 18S, 5.8S and 28S. During rRNA processing, the rRNA species must associate with more than 70 ribosomal proteins, as well as the 5S rRNA in the nucleolus, to form the small (S, 40S) and the large (L, 60S) ribosomal subunits, which are assembled and transported to the cytoplasm to initiate protein synthesis.

A Myc protoonkogén által kódolt fehérje mindhárom RNS polimeráz transzkripcióját serkenti, ezáltal a riboszóma bio- genezis mindhárom komponensének lértrejöttéhez hozzájárul UBF, upstream binding factor; SL-1, promoter selectivity factor; TIFIA, transcription intermediary factor IA; ERK, extracellular signal-regulated kinase; HAT, histone acetyltransferase.

A riboszóma biogenezis lépéseinek hibái tumorképződéshez vezethetnek The regulation of ribosome biogenesis is a highly coordinated process that leads to accurate initiation and regulation of protein synthesis. There are three steps in this process, which, when deregulated, can contribute to increased tumorigenesis. The first step in ribosome production requires the synthesis of the 45S rRNA precursor. The transcription of this rRNA gene is negatively regulated by tumour suppressors such as p53 and retinoblastoma (RB) and augmented on mitogenic stimuli by several kinases that phosphorylate components of the transcription complex that are responsible for 45S synthesis. The accurate regulation of rRNA synthesis can be lost in cancer cells through inactivating mutations in tumour suppressors or upregulation of these kinases.Another step in ribosome biogenesis that maintains accurate cellular function involves the modification of rRNA. One type of modification, which is catalysed by an enzyme known as dyskerin, converts uridine into pseudouridine ( ). Mutations in the gene encoding dyskerin, DKC1, result in increased tumour susceptibility. Animal models that have lost DKC1 function show a marked increase in tumour incidence associated with a decrease in rRNA processing. Ribosome assembly, which involves the association of rRNA with more than 70 ribosomal proteins (made in the cytoplasm), is another important step. The rRNA and proteins are assembled into the large subunit (60S) and small subunit (40S) of the ribosome. An increase in ribosomal protein production and activity has been observed in many cancer types. Mutations in ribosomal proteins such as S19 have also been associated with a human syndrome that is characterized by increased tumour susceptibility. Each of the three highlighted steps (blue boxes) might have deleterious effects on the cell that could contribute to tumour initiation or cancer progression, or both, through aberrant regulation of protein synthesis. This can be manifested either by an increase in ribosome production, thereby leading to an upregulation in total translation, or by alterations in translation of specific mRNAs, which are involved in the regulation of cell proliferation. Furthermore, when key checkpoints in the cell that are important in coordinating ribosome production with accurate cell-cycle progression are lost, 'nucleolar stress' can result, and subsequently unrestrained cellular proliferation occurs. The advent of proteomics will aid in identifying protein targets that are deregulated as a result of perturbations in these pathways.

A sejtciklus alatt számos fehérje akkumulálódik a magvacskában PTHrP = parathyroid hormon related protein; PPIγ = protein phosphatase Iγ; CDC14A =

A p53 és a magvacska kapcsolata HDM2(MDM2) = ubiquitin ligáz p53 = tumor szuppresszor p14ARF = tumor szuppresszor Normális sejt DNS károsodás és/vagy onkogén aktiválódás A p53 és a magvacska kapcsolata

A TIF-IA jelenléte nélkülözhetetlen a sejtmagvacska meglétéhez TIF-IA = transcription intermediary factor MDM2 = HDM2 = ubiquitin ligáz

A TIF IA génkiütés a magvacska szerkezetének megváltozásához vezet vad génkiütött

A TIF IA génkiütött sejtek magvacskájából kiszabaduló fehérjék a sejtmagban oszlanak el vad génkiütött

A RNS interferencia (RNAi) és a H3 hisztonmetiláció befolyásolja sejtmagvacska számot

EPIGENETIKUS MECHANIZMUSOK Transzkripciós Hiszton módosítások DNS metiláció Poszt-transzkripciós RNAi= RNS interferencia miR= mikro-RNS lincRNS = large intergenic non-coding RNS

RNS INTERFERENCIA (RNAi) – GÉN INAKTIVÁCIÓ: SPECIFIKUS GÉNEK ÉS FELTEHETŐEN ENDOGÉN VÍRUSOK, TRANSZPOZONOK, RETROVÍRUSOK

POSZT-TRANSZKRIPCIONÁLIS Indukáló dsRNS Új dsRNS Cél RNS vagy Széttekerés? siRNS DICER = dsRNS-függő endonukleáz RdRP = RNS-függő RNS polimeráz DICER RdRP Primer kapcsolódás RNS INTERFERENCIA/ POSZT-TRANSZKRIPCIONÁLIS GÉNCSENDESÍTÉS 1

POSZT-TRANSZKRIPCIONÁLIS (small interfering RNS) RNS INTERFERENCIA/ POSZT-TRANSZKRIPCIONÁLIS GÉNCSENDESÍTÉS 2 mRNS degradáció Nincs fehérje expresszió homológ siRNS (small interfering RNS) Kétszálú RNS oligonukleotid 21-23 nt TT 3’ túlnyúló szál RISC (RNS induced silencing complex)

RNAi vad The cells were fixed and stained for tubulin, actin and DNA

A RNS interferencia (RNAi) és a H3 hisztonmetiláció befolyásolja sejtmagvacska számot

A RNS interferencia (RNAi) és a H3 hisztonmetiláció befolyásolja sejtmagvacska számot

A normal Drosophila cell nucleus (left) contains just one well-formed nucleolus, shown in pink. The cell nuclei of Su(var)3-9 mutants (center and right) exhibit multiple irregular nucleoli. Karpen and Peng studied fruit flies with mutant Su(var)3-9 genes, flies that could not produce HP1 proteins or the proteins necessary to methylate H3K9. The results were dramatic. Because the ribosomal DNA genes could not be silenced, rDNA proliferated. These and other repeated DNAs became dispersed and disorganized throughout the cell nucleus. Instead of a single well-formed nucleolus where genes for ribosomal DNA were normally located in the heterochromatin, multiple nucleoli appeared in the nucleus.

A nukleoszóma kapcsolata más betegségekkel

45,X0 karyotípus

Turner- szindróma 139,5 cm

Turner szindróma Pterygium colli

Turner- szindróma Hydrops fetalis

Az alacsony termet magyarázatául szolgáló hipotézis RPS4 = kis riboszóma alegység proteint kódoló gén Az alacsony termet magyarázatául szolgáló hipotézis Ideograms of the X and Y chromosomes with the position of the lymphoedema critical region for both chromosomes indicated. The position of the pseudoautosomal boundary (PAB), the STS markers sY20 and sY45, the PAC clone dJ109C12, the Y chromosome genes SRY, ZFY, RPS4Y, TGIFLY, PCDHY, DBY, DFFRY, and SMCY, and their X chromosome homologues SOX3, ZFX, RPS4X, TGIFLX, PCDHX, DBX, DFFRX, and SMCX, the X chromosome genes VEGF-D, OTC, TALLA-1, NYX, CASK, GPR34, and IPP2H, and the pseudogenes NAPΨ and CASKΨ are also indicated.

Nucleostemin egy őssejt specifikus nukleáris komponens

A sejtmagvacska nucleosteminjének kimutatása Cells expressing a nucleostemin–GFP fusion (green) and labelled with anti-B23 antibody (red) show localization of nucleostemin in the nucleolus B23 = nucleophosmin = numatrin = nucleolar phosphoprotein