Strukturális genomika Gyakorlati feladatok

SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?

SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus

SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP?

SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1%

SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1% Hogyan lehet azonosítani?

SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1% Hogyan lehet azonosítani? ASA (AS-PCR)

SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP? Egypontos nukleotid polimorfizmus Milyen gyakori egy- egy SNP? Több, mint 1% Hogyan lehet azonosítani? ASA (AS-PCR) DNS szekvenálás

Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA (m) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA

Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA (m) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA

Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA (m) ◦CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA Tervezzünk primerpárt!

Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ Hány primerre lesz szükségünk?

Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5’ Hány primerre lesz szükségünk? 3

Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3 ’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.………… ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’

Allél specifikus amplifikáció - ASA (wt) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA T ……………… TAT GTA CGT AGC TGA 3 ’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA.…………….. ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’ (m) ◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TA C ………… TAT GTA CGT AGC TGA 3’ ◦3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG.………… ATA CAT GCA TCG ACT 5 ’

Primer tervezés programmal FAST PCR Ellenőrzés: MultAlin ◦ Reverz primer ellenőrzéséhez ◦

Emésztés RE-vel (wt) CGT AAT GAA TTC AGT TGC EcoRI akcióban

SNP van az RE helyen (m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC EcoRI akcióban

Emésztés RE-vel (m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC EcoRI akcióban

Gélelektroforézis

Gélelektroforézis m wt

ESE Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben Exon 1 Exon 2 Exon 3

ESE Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben Mi történik az RNS érés során? És mi történne, ha nem lenne mutáció? Exon 1 Exon 2 Exon 3

ESE Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3

Kromoszóma séta PCR-ral 5 tagú DNS könyvtár (mi a DNS könyvtár?) Állítsuk sorba a tagjait (mi a módszer alapja?) ◦AGT TGA ………GCT CGT GAA ◦GTA CGT AGT ….CGT TGC CGT ◦GTG AAT…..CGT AGT ◦TAG TAG CTT…..CTG TAC GTA ◦CGT ATG ….TGA AGT

: ligálás plazmid vektorba 1.: emésztés restrikciós endonukleázzal Genomkönyvtár készítés

3.: transzformáció Escherichia coli-ba : ligálás plazmid vektorba

Sanger-módszer Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról? Melyik DNS band melyik szekvenciával azonosítható? n A C G T GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT

Sanger-módszer Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról? Melyik DNS band melyik szekvenciával azonosítható? n A C G T GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT A3’ G T T G C T A C C5’

Sanger-módszer A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje? n A C G T A3’ G T T G C T A C C5’

A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje? GGTAGCAACT Sanger-módszer n A C G T A3’ G T T G C T A C C5’

Piroszekvenálás A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? Mi a templát DNS bázissorrendje?

Piroszekvenálás A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A Mi a templát DNS bázissorrendje?

Piroszekvenálás A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A Mi a templát DNS bázissorrendje? CGTCCGGA

KRAS gén analízis piroszekvenálással KRAS onkogén 12p12 RAS család tagja, GTPáz 21kD-s fehérjét kódol (p21ras, vagy K-Ras) K-Ras funkció: molekuláris kapcsoló ◦intracelluláris jelutak szabályozása ◦pl: EGFR közvetítette jelátvitel során „downstream” jelátviteli affektor.

KRAS gén analízis piroszekvenálással A KRAS gén BIOMARKER Jelzi, hogy hogyan fognak reagálni a betegek a kezelésre Szabályozza egyes fehérjék működését befolyásolja a sejt túlélését, a daganat érképzését, az áttétképződési folyamatot.

KRAS gén analízis piroszekvenálással

Mutáció a KRAS génben -> folyamatosan aktív K-Ras protein -> szabályozatlan sejtosztódás -> számos rák alapja Leggyakoribb mutációk:12., 13., 61. kodon

KRAS gén analízis piroszekvenálással