Monitorozás

bevezető Környezeti változások (folyamatos, hosszabb távú megfigyelések jelentősége) Szennyezések kimutatása Szennyezőanyag tulajdonságai Megengedett határértékek EC (Európai Bizottság), EPA (Environmental Protection Agency = Amerikai Környezetvédelmi Iroda) Molekuláris biológia (bioremediációs eljárások, monitoring gyors fejlődése)

Szennyeződések Fő szennyező források: ipar mezőgazdaság bányászat közlekedés szakszerűtlen hulladéklerakás háztartás Talajszennyezés megnyilvánulása: pH csökkenés toxikus elemek, vegyületek felhalm. kémiai összetevők arányának változása Környezet- és állapot- felmérés szükséges: talajszennyezés módja kiterjedtsége terület szennyezés előtti/utáni haszn. geokémiai jellemzők szennyeződés kora

Talajszennyezések vizsgálata Pontszerű vagy kiterjedt Természetes eredetű és/vagy antropogén Szervetlen és/vagy szerves: nehézfémek kőolaj és kőolajszármazékok PAH, PCB, BTEX felületaktív anyagok növényvédő szerek A szennyezőanyag fizikai állapota : folyadékfilm talajrészecskékhez felületi adsz. talajpórusokban szilárd v. folyadék mikrokapillárisok vizes fázisában

talajhoz adszorbeálódik Talajban mozogva eléri a talajvizet A szennyezőanyag sorsa a környezetben függ az anyag tulajdonságaitól és a környezeti viszonyoktól Szennyezőanyag nem illékony illékony oldható Nem oldható Levegő szennyezés talajhoz adszorbeálódik Perzisztens marad mineralizálódik Széntetraklorid CFC-k Víz szennyező peszticidek Talajban mozogva eléri a talajvizet kőolajszármazékok Nem bontható lebomlik Akkumulálódik vízben, talajban, táplálkozási láncban PAH-ok Kőolajszárm. PCB-k, DDT

monitorozás Szükséges a folyamatos és pontos mintavételezés Talajok, álló-,folyó-, talajvizek, ill. levegő minőségének meghatározása fizikai, kémiai, biológai vizsgálatokkal Gyakran igen sokféle szerves anyag, egyenkénti mennyiségi meghatározása (sőt kimutatása is) rendkívül körülményes.

A szennyezett talajok, vizek állapotfelmérésére alkalmazott módszerek Fizikai analizis Gravimetria (tömeghatározási módszer, ahol a meghatározandó komponenshez fokozatosan reagenst adunk, és a levált csapadék tömegét mérjük) pH (pH elektród) Kolorimetria (koloriméter, spektrofotometria) szín és zavarosság mérésére pl. vízminőség mérés Oldott oxigénszint (oxigén elektród), szintén vízminőség meghatározásra Ionok jelenlétének mérése (ionspecifikus elektród)

A szennyezett talajok, vizek állapotfelmérésére alkalmazott módszerek Kémiai analizis kromatográfia nem illékony, oldékony szennyezők:folyadékkr. HPLC illékony komponensek: gázkromatográfia GC (-MS) spektroszkópia Szénhidrogének (olajszennyeződések) : infravörös spektr. (IR) Ásványi anyag tartalom - fémek, kén, foszfor: plazmaemissziós spektrometria (ICP) Spektrofotometria UV/VIS Atomabszorbciós spektrometria (AAS): fémek kimut. Tömegspektrometria (MS) Kémiai oxigénigény (KOI)

A szennyezett talajok, vizek állapotfelmérésére alkalmazott módszerek Biológiai analizis Sejtszám-, sejttömeg meghatározás Mikroflóra feltérképezése Biológiai oxigénigény (BOI) Molekuláris biológiai, biokémiai vizsgálatok - metegenom analizis, proteomika Bioindikátorok, biomarkerek, bioszenzorok

Biológiai úton lebontható, kimutatható szervesanyagok monitorozása

Biológiai oxigénigény (BOI) BOI azt az oxigénigényt méri egy mintában, melyre a metabolizálható szervesanyag tartalom biológiai oxidálásához szükség van. Csak a biodegradálható anyagokat mérjük Jó, de nem tökéletes Alternatíva: KOI (az összes oxidálható anyagot mérjük), ill. TOC (összes szerves szén tartalom) Pontosabb, amikor a KOI/BOI arányát vesszük figyelembe Szennyezés monitorozása, koncentráció meghatározás, stb. kémiai: biológiai: GC, LC, MS, IR, NMR… bioindikátorok, biomarkerek

Bioindikátorok A környezetben egy reprezentatív, ép szervezet, melyre hat a szennyezés Olyan szervezet lehet, melyen keresztül a szennyezés hatása meghatározható, mennyiségileg megadható, széles körben elterjedt, helyhez kötött (nem vándorol el), egész évben jelen van, könnyen begyűjthető, szenzitív a szennyezésre Mi az ami változni fog: ökológiai (pl. populáció sűrűség, a kulcs faj ill. fajdiverzitás változásai), visélkedésbeli (aktivitás vátozás-tápanyagfelvétel, mobilitás), fiziológiai (pl. nehézfém akkumuláció, CO2 termelés, oxigénigény) változások, melyek megfigyelhetők Példák: földigiliszta, méh, zuzmó, moha, kagyló, algák Főleg a moha, zuzmó megfelelő, mivel nem mobilis, könnyen begyűjthető, a zuzmó nagyon érzékeny – levegő minőség vizsg. Jó Méhek a fémszennyezésekre haszn., a begyűjtött pollen, méz, viasz Kagylók a vizek fém-, és akár szervesanyag szennyezésének detekt.

levegő szennyezésre talaj szennyezésre víz szennyezésre

Biomarkerek A biológiai rendszerekben történő változásokat biomarkerek segítségével mennyiségileg mérhetjük, melyek fiziológiai, biokémiai, molekuláris biológiai karaktere egy a környezetben jelenlévő szervezetnek, melyre hat a szennyezés Előnye a kémiai analizisekkel szemben, hogy hosszabb időn keresztül végezhetjük a méréseket 3 csoport: biokémiai-, genetikai-, immunkémiai markerek

Biomarkerek Biokémiai markerek: megváltozik azoknak a specifikus enzimeknek a mennyisége, melyek a szennyezés ártalmatlanításában részt vesznek (ez esetben valójában a gén expresszió mértéke ad információt a szennyező anyag koncentrációjáról, azaz gén szinten is mérhető a válasz) példák: osztriga - metallotionein fehérje – fémek jelenlétében kagyló – glutation fehérje mennyisége igen sokféle szennyezésre tengeri csillag - citokróm P450 pl. PAH-ok jelenlétében növények - aril hidroxiláz pl. dioxin szennyezésre

Biomarkerek ELISA Immunkémiai markerek Szennyező ellen fejlesztett antitest antigén Biotin jelölt antitest Jelölt streptavidin ELISA Immunkémiai markerek az antigén-antitest specifikus reakció kihasználható xenobiotikumok jelenlétének kimutatására is: antitesteket elő lehet állítani különböző vegyületek, szerves anyagok pl. PCB-k, dioxinok … stb. ellen, és ennek segítségével un. ELISA (enzim kapcsolt immunszorbens teszt) fejleszthető ki a szennyezők detektálására

Biomarkerek Genetikai markerek A leggyorsabb, és legérzékenyebb módszerek egyike a génexpresszió ellenőrzése példa: látványos eredményt érhetünk el, ha zöld fluoreszcein fehérjét kódoló génszakaszokat építünk be speicifikus helyekre (mely szakaszok transzkripciója a szennyezés hatására megváltozik) a genomba, így, amikor e baktérium toxikus anyaggal találkozik „fény gyullad” benne

Bioszenzorok A bioszenzor olyan érzékelő (szenzor v. detektor), amely biológiai rendszert v. annak valamely részét, pl. biokémiai reakciókat, enzimeket, ellenanyagokat, receptorokat v. mikroorganizmusokat stb. használ fel valamilyen jel felismerésére vagy kimutatására. Ezek a biológiai anyagok szolgáltatják az érzékelés sajátosságát főként akkor, ha a mérendő jelet másképpen nehéz szelektíven meghatározni. A bioszenzor rendszerint elektromos jelet hoz létre, amely azután elektromos v. elektronikus berendezésekkel már feldolgozható. Előnyei: gyors, nagyon specifikus válasz, folyamatos érzékelés… Hátrányok: biológiai anyag lévén nem sterilizálható, életideje véges…

Bioszenzorok MENNYISÉGI ANALÍZIS ADATFELDOLGOZÁS Vezetőképesség Optikai Oxigénelektród Ion szelektív e. pH elektród Fotodióda … Fehérjék Hormon receptorok Lektinek DNS Antitestek Szervecskék Teljes/ép sejtek JELÁTALAKÍTÓ BIOLÓGIAI ANYAG MINTA

Immobilizált mikroorganizmusok Hagyományos Clark oxigénelektród Bioszenzorok Példák: Clark oxigénelektródon alapuló bioszenzor: BOI bioszenzor – oxigénszint változásának mérése, gyors, folyamatos mérési lehetőség Ezüst anód Ezüst klorid elektrolit platinum katód gáz áteresztő teflon membrán Immobilizált mikroorganizmusok dializis membrán BOI bioszenzor Ezüst anód Ezüst klorid elektrolit platinum katód membrán Hagyományos Clark oxigénelektród Minél több a metabolizálható anyag a tápoldatban, annál nagyobb a metabolikus aktivitása a sejteknek, ezáltal gyorsabb az oxigénredukció, ez mérhető az elektróddal

Bioszenzorok Peszticidek kimutatására acetilkolin észteráz + kolin oxidáz: az acetilkolin észteráz az acetilkolinból kolint képez, a kolin oxidáz ezt hasítja betainra és H2O2-ra. A H2O2 képződése amperometrikusan mérhető oxigénelektród segítségével. A peszticidek gátolják az acetilkolin észteráz aktivitását, így peszticid jelenlétében kevesebb H2O2 képződik. Fenol bioszenzor a fenol oxidációján alapszik, mely pl. tirozináz v. más oxigenázok segítségével katekollá, ill. kinonná alakul. Az oxigenáz enzimek katalizálta reakióhoz oxigénre van szükség. Ha a rendszerbe oxigénelektródot kapcsolunk, mérhető az oxigén felhasználás. Az enzim aktivitás toxikus anyagok gátolhatják ezáltal csökken az oxigén felhasználás, ami detektálható (már 50 ppb konc. szint csökkenést mérni tudunk) fémszennyezés kimutatására is használható

Toxicitás tesztek Általában egyféle szennyezőt kimutató, egy fajt alkalmazó biotesztek, melyek válasza a szennyezőanyag akut toxikus hatását mutatja és csak kevéssé képesek a hosszú távú hatások jelzésére (gyakran rövid ideig tartó vizsgálatok). Az akut hatások jelzőszáma a LC50 (a vizsgált faj 50 %-nak elpusztulását eredményező konc.) A tesztorganizmust körültekintően kell kiválasztani, hogy a kapott eredmény alapján következtetéseket vonhassunk le a magasabb trófikus szintek élőlényeire. A különböző tesztorganizmusok érzékenysége egy adott szennyezőanyagra nagy változatosságot mutat. Egy ökoszisztéma érzékenységét a legérzékenyebb fajok érzékenysége határozza meg. Ezért gyakran a szennyezőanyagra legérzékenyebb fajt választjuk tesztelésre. Tesztorganizmusok pl: mikroorganizmusok, algák, vízi bolha, halak, madarak Tesztek: lumineszkáló szervezetekkel – MICROTOX, BIOTOX, ToxAlert…; Ames teszt, mol. biol. markereken alapuló tesztek

metagenom

biodiverzitás Bár a mikrobák központi szerepet játszanak a biotikus folyamatokban, nagyon keveset tudunk valós sokféleségükről Fizikai, kémiai, biológiai paraméterek Mikrobiális diverzitás, katabolikus gének Szaporítható/nem szaporítható mikroorganizmusok Környezeti metagenom könyvtár

A Földön előforduló fajok becsült száma, és a szaporítható mikroorganizmusok aránya a különböző élőhelyeken Ismert, leírt fajok száma (x1000) becsült fajok száma (x1000) % ismert fajok A mikroszkópikusan detektálható fajokból a szaporíthatók aránya Noha a mikróbák központi szerepet játszanak a biotikus folyamatokban, nagyon keveset tudunk valós sokféleségükről Jelenleg kb 5000 prokarióta fajt ismerünk, de a becsült számuk több, mint 1 000 000! A molekuláris technikák fejlődésével új lehetőségek A nem szaporítható prokarióták genetikai és biotechnológiai jelentősége hatalmas

Miért fontos, hogy megismerjük a lehető legtöbb mikróba fajt? Alapvető szerepet játszottak a bioszféra kialakulásában A biogeokémiai ciklusok a mikrobákkal teljesek csak Meglepően nagy fiziológiai, biokémiai változatosságot mutatnak Képesek extrém körülmények között élni Központi szerepet játszanak életünkben, mégis nagyon keveset tudunk róluk Molekuláris technikák fejlődésével a mikrobiális ismereteink gyorsan és jeletősen bővülnek A különböző élőhelyek mikrobiális sokféleségét akkor tudjuk analizálni, ha a teljes genomot kinyerjük a vizsgálandó élőhelyről gyűjtött mintából (metagenom)

Talaj metagenom A talaj nagyon összetett élőhely A mikrobiális heterogenitás a talajban felülmúl minden más környezetet: kimutatták, hogy 1 g talaj több ezer faj akár 10 milliárd egyedét is tartalmazhatja! A talaj mikroorg-k ált. a talajmátrixhoz kapcsolódnak A sejtek lehetnek egyedül, vagy mikrokolóniát alkotnak, gyakran poliszaharid burokba ágyazva A mikrokörnyezet jelentősen befolyásolja a sejtek szaporodását, aktivitását, így két egészen közeli mikrokörnyezet is nagyon eltérhet egymástól. Ez a heterogenitás eredményezi a mikrobiális élőhelyek nagy változatosságát és a mikrobák sokféleségét Jogos tehát a várakozás, hogy a talaj metagenom genetikai sokfélesége még tartogat meglepetéseket, és gazdag forrása lehet ipari jelentőségű enzimek, bioaktív anyagok felfedezésének

DNS kinyerése a környezeti mintából Komoly problémát jelent, hogy az in situ megfigyelhető mikróba sokféleség, és a szaporító tápon in vitro számolható telepszámok (számlálási anomáliák) között eltérés mutatkozik Torsvik és Goksoyr (1970-es évek végén) - a mikrobiális DNS közvetlen izolációjának lehetősége környezeti mintákból (elvi felvetés). Később Pace és mtsai: a metagenomot környezeti mintából extrahálták, részlegesen emésztették, a fragmenteket vektorba ligálták, E. coli-ba klónozták, és az rRNS-ket kódoló géneket vizsgálták A talaj a legjobb környezet a mikrobiális sokféleség vizsgálatára, de komoly hátránya, hogy a DNS kinyerése során huminsavak is extrahálódnak, melyek gátolják a molekuláris munkákat

DNS kinyerése a környezeti mintából A DNS kinyerésére környezeti mintából kétféle extrakciós módszert dolgoztak ki: lehet direkt kinyerése a DNS-nek - sok DNS, egyszerű extrakciós eljárás Vagy először elválasztjuk a környező anyagoktól a sejteket, és utána extaháljuk a DNS-t - tiszta, nagyon jó integritású DNS Attól függően, hogy mi a célunk használhatjuk a két módszer egyikét, pl. egy egyedi enzimet kódoló gén kinyeréséhez alkalmazható az első megoldás, míg multifunkcionális enzimeket kódoló géncsoportok izolálásához célszerű a második módszert használni

DNS extrakciós módszerek összehasonlítása Frakcionálás alapú (közvetett) először elválasztjuk a környezeti minta anyagaitól a sejteket (ezután gyakran felszaporítjuk), és utána extraháljuk a DNS-t Tiszta, nagyon jó integritású DNS nyerhető Olyan talajminták esetén előnyös, ahol nagy mennyiségű olyan anyagot találunk, amelyek zavarják a DNS izolációt (pl. huminsavak) Nagyobb DNS fragmentek, nagy-inszert könyvtár készítésére alkalmas Közvetlen lizis A sejtek (nem választjuk el a környezeti mintából) lízisét a DNS tisztítása követ A sejtek lizisére magas hőmér-sékletet, erős detergenseket, mechanikai törést vagy fagyasztás-olvasztás módszert alkalmazhatunk Jobban reprezentálja a minta valós mikrobiális sokféleségét Leggyakrabban ezt használják, mivel sokféle talajra alkalmaz-ható, kevésbé laborigényes, több DNS nyerhető Hátránya: kisebb DNS fragmentek keletkeznek

DNS kinyerése a környezeti mintából A genetikai anyag önmagában nem elegendő a mikrobiális környezet megismeréséhez, minket elsősorban az érdekel, hogy mit tudnak milyen fontos tulajdonságot hordoznak számunkra és a környezet számára milyen funkcionális fehérjéik, egyéb molekuláik vannak ezen tulajdonságokhoz, fehérjékhez, egyéb sejt által termelt anyagokhoz hogyan juthatunk hozzá

A szaporítás alapú (közvetett) és metagenom alapú (közvetlen módszer) biokatalitikus termék kinyerés összehasonlítása Mikrobiális diverzitás bioszféra izoláció Metagenom izoláció Transzformáció gazdasejtbe Vektorba ligálás DNS izoláció Rekombináns enzimek Enzim karakterizáció Szaporítás Karakterizáció fermentáció A szaporítás alapú (frakcionálás, közvetett) megközelítéssel a jelenlévő mikróbáknak csak egy részét lehet szelektálni és szaporítani tiszta kultúrában. A szaporítható mikroorg-k jellemezhetők, fermentálhatók, és a termék közvetlenül kinyerhető, vagy a gének további tisztítása, klónozása és expressziója szükséges. A nem szaporított mikroorganizmusok viszont csak genomjuk extrakciójával hozzáférhetők (közvetlen módszer). Ez esetben az adott környezet összes mikroorganizmusának teljes genomját izoláljuk és klónozzuk egy gazdába (pl. E. coli) a további vizsgálatokhoz és termék termeltetéshez.

Általánosan használt technikák a molekuláris mikrobiális ökológiában Dúsítás és szaporítás Környezeti minta Nukleinsavak extrakciója Specifikus DNS szakaszok felsokszorozása (PCR) PCR termék vektorba zárása Vektorok E. coli-ba juttatása Az egyedi klónok karakteri-zációja Elektroforeti-kus nalizis Tiszta kultúrák Specifikus DNS szakaszok azonosítása Próba specifikus oligonukleotidokkal

Metagenom analizis Az a felismerés, hogy a környezetben élő mikroorganizmusok többsége nem szaporítható standard módszerekkel, ösztönzőleg hatott a metagenomika fejlődésére, melyet úgy definiálhatunk, hogy a mikroorganizmusok szaporítása nélküli genom analizis Két típusa: Funkció alapú analizis – a kifejeződő tulajdonságokat keressük, vizsgáljuk Szekvencia alapú analizis – a könyvtárat egyedi szekvenciák keresésével hozzák létre

A DNS-t hordozó vektor a ligálás után Genomi DNS extrakció környezeti mintából Szekvencia alapú analízis Vektorba ligált DNS transzformáció E. coli sejtekbe Genomi DNS-ek A DNS-t hordozó vektor a ligálás után Hasított vektor Funkció-alapú analízis Metagenom analízis

Metagenom analizis Amikor egy környezeti mintából kifejezetten egy bizonyos funkciót szeretnénk megtalálni, egy bizonyos enzim aktivitását kimutatni, nyomon követni több megközelítés lehetséges: Bróm jelölt uracil használata, mely a metabolikusan aktív sejtek RNS-eibe épül be Izotóp jelölt szubsztrátot alkalmazunk, mely a metabolikusan aktív sejtek szervesanyagaiban jelenik meg A környezeti mintából kinyert DNS szakaszokat vektorba építve, pl. E. coli sejteket használva, azok a sejtek tudnak szaporodni, melyek a szubsztrát bontásáért felelős géneket/ tulajdonságokat hordozzák Számos egyéb lehetőség is létezik

Specifikus (egy bizonyos tulajdonságért felelős) DNS szakaszok dúsítása környezeti mintából különböző technikákat alkalmazva