Oligonukleotid szintézis Mintegy 50 éves múlt 5 különböző kémia: foszfáttriészter, fosztittriészter, foszfátdiészter Foszforamidit, H-foszfonát Szilárd fázisú szintézis: hordozó: controlled pore glass (CPG), vagy polisztirol Mind DNS mind RNS szintetizálható mind a két módszerrel

Oligonukleotid szintézis: monomerek

Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer B B 1 1 O H hordozó B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % Ac 2 O O H hordozó B 1 B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O O di-MeO Tr O O I 2 / H 2 O B di-MeO Tr O 1 B O 1 O O O O O P O O N C P O O O N C O O hordozó hordozó

Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer, alternatív kép

Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER Előny: az oxidációt elég a végén elvégezni, vagy – igény szerint – el sem kell  töltés nélküli molekula  Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon

Egy-két automata szintetizátor

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE I. - Deblokkolás: védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: - védőcsoportok a bázisokról - -cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról - liofilezés, sómentesítés

OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE II. - méret szerinti elválasztás, PAGE, vagy HPLC (sokszor nem szükséges) Ioncserés kromatográfia Hidrofób kromatográfia a DMT csoporton keresztül - kvantitálás bázis e(µmol * cm/cm3) dA 15.4 dG 11.7 dC 7.5 dT 8.8 átlagosan e = 10 (µmol * cm)/cm3

OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK - primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika - antiszensz oligonukleotidok, génterápia   - gén darabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.

egyik vég ragadós, a másik tompa. Linkerek rövid, önkomplemeter oligonukleotidok, amelyek saját magukhoz hibridizálva olyan tompa végű, kettősszálú DNS-t képeznek, amely tartalmazza egy tetszőleges restrikciós endukleáz felismerő helyét: Restrikciós hely bevitelére alkalmas BamHI...........CGGATCCG EcoRI...........GGAATTCC PstI............GCTGCAGC ADAPTEREK szintetikus kettősszálú oligonukleotidok, amelyek végei kompatibilisek különböző restrikciós endukleázokkal végzett emésztések során képződő végekkel. Esetenként valamilyen restrikciós endonukleáz felismerőhelyét tartalmazhatja. Hosszú adapterek: két ragadós vég között egy harmadik restrikiós endonukleáz felismerõhelye Rövid adapterek: egyik vég ragadós, a másik tompa. EcoRI pl. BamHI (ApaI) SacI EcoRI – SmaI...5'AATTCCCGGG 3‘ 3’GGGCCC 5’ 5' GATCCGGGCCCTGTTAGAGCT 3' 3' GCCCGGGACAATC 5' SmaI

Primerek szintetikus oligodeoxinukleotidok, amelyek iniciációs pontjaiként szolgálnak a templát függő DNS polimerázok számára. Univerzális primerek: a gyakorlatban elterjedt vektorok klónozó helyének környékére tervezett primerek. Specifikus primerek: az adott feladatnak megfelelően szintetizált speciális szekvenciájú oligonukleotidok.

Polimeráz láncreakció I. Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb. Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló

Polimeráz láncreakció II.

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ MÓDOZATAI - belső PCR, specificitás növelése belső primerek használatával egy elsődleges PCR terméken   - egy specifikus primert használó PCR + primer adapter limitált információ esetén - LM PCR, ligálás közvetített PCR, kromoszóma metiláltsági térképezésére - inverz PCR, szegélyező szekvenciák izolálására - “farkazott PCR” ld. cDNS izolálás - RT PCR, reverz transzkripció kapcsolt PCR, ld. cDNS - kvantitatív PCR, mRNS mennyiségének becslésére

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI  klónozás, megfelelő DNS szakaszok kinyerése, esetenként degenerált primerekkel    DNS szekvenálás, pl. ThermoSequenase  mutagenezis  szálspecifikus próbák előállítása  diagnosztika  fertőzések kimutatására  mutáns allélek kimutása

BELSŐ (NESTED) PCR 1. PCR 2. PCR 2 primer párt használunk  nagyobb specificitás, a nemspecifikus termékek eltűnése  költségesebb

EGY SPECIFIKUS PRIMEREN ALAPULÓ PCR GÉN 'A' hasítás 'A' enzimmel ligálás primer/adapterrel PCR Potenciális melléktermék: 'A' elkerülésére megoldás: a primer adaptor feleslegben való alkalmazása

LM PCR, ligálás közvetített PCR, kromoszóma metiláltsági térképezésére GÉN 'A' hasítás 'A' enzimmel ligálás primer/adapterrel PCR ha “A” metiláció érzékeny  nincs termék ha “A” izoskizomerje érzéketlen metilációra  van termék

INVERZ PCR A géneket környező régiók kiamplifikálkására Általában a gén szekvenciája részben vagy teljesen ismert  primer pár tervezhető A hasítás 'A' restrikciós enzimmel önligálás PCR 'A'

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT PCR (RT-PCR) mRNS antiszensz primer reverz transzkripció reverz transzkriptázzal AMV: avian mieloblastosis virus RT MMLV: Moloney murine leukémia vírus RT Tth: Thermus thermophilus, Mn2+ jelenlétében cDNS szensz primer PCR Gének szerveződésének vizsgálatára 250 500 750 1000 RT+ RT- gK bp

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT KVANTITATÍV PCR Az RNS preparátumnak DNS mentesnek kell lennie exponenciális rész lineráris szakasz plató ciklus szám termék Hagyományos PCR-rel igen nehéz a termék mennyiségének a meghatározása

Real-time PCR T : SYBRGreenI : fluorescens SYBRGreenI Denaturálás Hibiridizáció DNA szintézis Real-time PCR : SYBRGreenI : fluorescens SYBRGreenI

Real-time PCR reakció analízise Kalibráció ismert mennyiségű genomiális DNS-sel reprodukálhatóság ismeretlen mennyiségű templát cDNA-sel. 280ng 28ng 2.8ng 0.28ng 0.028ng gDNA:

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: klónozás

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: DNS szekvenálás templát DNS ddATP/dNTP PCR egy primerrel ddA terminálódott láncok száma lineárisan sokszorozódik

A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: mutagenezis random: a Taq polimeráz átírási hűsége rosszabb, hibák épülnek be és amplifikálódnak 1-2 hiba 1 kb hosszon Mn2+ vagy nukleotid analógok (inozin) növelik a mutációs rátát in vitro evolúció irányított: O1 Mf BamHI XhoI Mr O2 O1-Mr 1st PCR-s Mf –O2 O1 BamHI XhoI CO2 2nd PCR O1 – O2 XhoI BamHI digest with XhoI and BamHI ligate into XhoI – BamHI digested vector

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I. - FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket  speciálisan tervezett primerek segítségével PCR a termék megjelenése fertőzésre utal

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II. MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA normális C gén mutáns 5' 3' A C 5' 3' PCR egészséges nincs termék beteg

Diagnosztika optimalizálás +C R R M 60oC 62oC 64oC 66oC XhoI BamHI

ligálás, termostabil ligázzal ligálás, termostabil ligázzal Ligáz láncreakció 5’ 3’ A T denaturáció, hibridizáció 4 primeres, A PCR-t nem tudta kiszorítani 5’ 3’ A T ligálás, termostabil ligázzal denaturáció, hibridizáció 5’ 3’ A T A 5’ 3’ T ligálás, termostabil ligázzal 5’ 3’ A T T 3’ 5’ A

Ligálás és a PCR kombinálása

GÉNSZINTÉZIS STRATÉGIÁK 1. Szintetikus DNS fragmentek összeállítása átfedő oligomerekből 1. fragment 2. fragment 1+2. fragment 3. fragment 1+2. fragment 1+2+3. fragment hátrány: drága, mind a két szálat meg kell szintetizálni

2.a. Hajtű módszer 2. Fragment összeállítás primer-templát módszerrel 3’ 5’ 5’ 3’ Klenow, dNTP 5’ 3’ 3’ 5’ Több verzió is erre az enzimatikus feltöltési elvre alapszik. 2.a. Hajtű módszer 5’ 3’ Klenow, dNTP emésztés restrikciós endonuklázokkal ligálás

2. c. Fragment összeállítás a javító mechanizmus (gap repair) kihasználásával Híd ligálás 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ átfedő szintetikus oligonukleotidok hasított vektor hibridizálás, enzimatikus feltöltés hasított vektor 5’ 3’ 3’ 5’ polimerizáció Klenow, dNTP ligálás közvetlen transzformálás transzformálás

A humán szérum albumin HSA szintézise 1864 bp hosszú géne, 60 kDa méretű fehérje. Magyar projekt, svéd megbízásból SZBK, Biotechnika Rt. 5 kutatója Eleinte még manuális oligo szintézis A szintézis oka: élesztőben termeltetni  vérpótló szer A gént négy kb egyenlő részre osztottál, mindegyik kb 450 bp hosszú, Ezeket klasszikus klónozással illesztették össze 5’ 3’ minden darabot 40-50 bp-os oligokból illesztettek össze

Negyed HSA szintézis stragégiája pC G CTTAAOH CCCGGG pN GGGCC HSA1 ApaI-EcoRI adapter ligálás AATTC G pN GGGCCC CCCGGG G CTTAAOH pN GGGCC HSA2 pC G CTTAAOH CCCGGG G CCTAG AATTC G 1. ligálás 2. tompítás 3. ligálás ApaI-EcoRI adapter ligálás pN GGGCCC CCCGGG G CTTAAOH GGGCCC CCCGGG G CTTAA GGATCN CCTAGN HSA1 AATTC EcoRI-ApaI hasítás GGGCCC C GGATCN CCTAGN HSA1 AATTC G 1. ligálás 2. tompítás 3. ligálás G C GGATCN CCTAGN HSA1 GGGCCC CCCGGG G CTTAA HSA2 AATTC