Készítette: Kozma Réka A talajban élő aerob nitrogénfixáló baktériumok izolálása és azonosítása Készítette: Kozma Réka

Bevezetés, alapfogalmak Nitrogénfixáló, diazotróf baktériumok: A nitrogén az egyik legfontosabb elem az élő szervezetek számára. Bár a levegő 78%-a nitrogén, a fejlettebb élőlények közvetlen módon azt nem tudják hasznosítani. A talajban, főleg a rizoszféra szintjén élő nitrogénfixáló, ún. diazotróf baktériumok képesek a nitrogén megkötésére; ehhez aerob közeg, tehát levegő, illetve oxigén jelenléte szükséges. A diazotróf baktériumok a molekuláris N2-t, a légkör elemi nitrogénjét képesek megkötni és nitrogenáz enzim segítségével a növények számára hozzáférhető ammóniává redukálni. 1 mol N2 redukálásához 16 mol ATP és 8 elektron szükséges az alábbi reakcióegyenlet szerint N2 + 10 H+ + 8 e-  2 NH4+ + H2

Visszatekintés 1970-es évekig : Kizárólag olyan aerob diazotróf baktériumok voltak ismertek, melyek rendelkeznek ún. „oxigén-védelmi” mechanizmussal, ami megvédi a nitrogenáz enzimet az oxigéntől Ezek a baktériumok az Azotobacter, Azomonas, Derxia és Beijerinckia nemzetségek tagjai, melyekre kevéssé jellemző a növényekkel való társulás 1970-es évektől: Új, oxigén-védelmi mechanizmussal nem rendelkező fajokat fedeztek fel, melyek azonban hatékonyabbnak bizonyultak a nitrogénfixációhoz szükséges szénhasználat tekintetében Ezek a leggyakoribb növényhez kötődő diazotrófok az Azospirillum, Herbaspirillum, Azoarcus és Acetobacter nemzetségekhez tartoznak.

Izolálási és azonosítási módszerek - Döbereiner A módszer lényege: Az Azotobacter, Azomonas, Derxia és Beijerinckia nemzetségekhez tartozó fajok levegővel inkubált agarlemezeken ellenálló telepeket képeznek, megvédve a nitrogenáz enzimet az oxigéntől. Ez az oxigén-védelmi képesség egyszerűbbé teszi az izolációt, mivel semmilyen más baktérium nem tud növekedni ilyen tápagaron. Szükséges készülékek és eszközök: 25 és 35 oC között szabályozható inkubátor Petri csészék Szilikagél lemezek Autokláv Tiszta munkafelület Steril üvegeszközök Mikroszkóp

Izolálási és azonosítási módszerek - Döbereiner Vegyszerek és oldatok I. : Azotobacter és Azomonas izoláláshoz szükséges tápagar (LG tápagar): 20 g szacharózt, 0,05 g K2HPO4-ot, 0,15 g KH2PO4-ot, 0,01 g CaCl2-ot, 0,2 g MgSO4.7H2O-t, 2 mg Na2MoO4.2H2O-t, 0,01 g FeCl2-t, 2,00 ml 0,5 %-os etanolban oldott brómtimolkéket, 1 g CaCO3-at és 15 g agart feloldunk 800 ml desztillált vízben, majd desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel Derxia izoláláshoz szükséges tápagar: ugyanaz, mint az Azotobacter esetben, azzal az eltéréssel, hogy a szacharóz helyett glükózt vagy keményítőt, valamint a CaCO3 helyett 0,01 g NaHCO3-ot használunk Beijerinckia izoláláshoz és szilikagél lemezek előkészítéséhez szükséges közeg: A oldat: 1,1-es sűrűségűre hígított HCL oldat B oldat: 1,06-os sűrűségű Na2O5.SiO2 (vízüveg) oldat Winogradsky só –oldat (C oldat): 5 g KH2PO4-ot, 2,5 g MgSO4.7H2O- t, 2,5 g NaCl-ot, 5 mg Na2MoO4.2H2O-t, 0,05 g MnSO4.4H2O és 0,05 g Fe2(SO4)3-ot feloldunk 800 ml desztillált vízben, beállítjuk a pH-t 6,5- re, majd desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel

Izolálási és azonosítási módszerek - Döbereiner Vegyszerek és oldatok II. : Folyamatos kevergetés mellett 503 ml A oldatba 500 ml B oldatot öntünk, majd az elkészült oldatot azonnal 30 ml-es Petri csészékbe osztjuk szét Ezeket 24-48 órán keresztül hagyjuk szilárdulni, majd folyó víz alá helyezzük körülbelül 3 napra, mindaddig, amíg az AgNO3-teszt negatív nem lesz kloridra Az ilyen módon elkészített lemezek hónapokig eltarthatóak zárt edényben Használat előtt a maradék klorid eltávolítása végett a lemezeket forró desztillált vízbe merítéssel kell sterilizálni Ezután glükózt adagolunk a Winogradsky oldathoz a 10%-os koncentráció eléréséig Ebből 2 ml-es mennyiségeket kis kémcsövekben forrásig melegítünk, majd a felforralt mintákat lemezekre öntjük, amelyek így száríthatóvá válnak tiszta szárító sütőben

Optimális növekedési hőm. (oC) Első telepek megjelenése (h) Izolálási és azonosítási módszerek - Döbereiner Az eljárás: A táptalajt tartalmazó lemezeket mintegy 100 mg-nyi finomra szitált talajjal, illetve megfelelő hígítású talajmintával oltjuk be Az egyes baktériumfajok az alábbi módon reagálnak: Az egyes baktériumfajok viselkedése levegő alatt inkubált, nitrogénmentes agarlemezen   Azozobacter A.paspali Azomonas Beijerinckia Derxia Optimális növekedési hőm. (oC) 25-32 30-35 25-30 25-35 Optimális pH 6.5-8.0 5.5-7.8 6.5-7.5 4.5-6.0 5.5-8.0 Első telepek megjelenése (h) 24 48 na Telepek színe fehér, majd sötét barna fehér, középen sárgás fehér fehér, majd barna Telepek mérete(μm) 3 × 6 10-15 × 2 1 × 3 1-1,2 × 3-6

Izolálási és azonosítási módszerek - Döbereiner Derxia fajok izolálása és azonosítása: A D.gummosa azonosítása egyszerűbb 35 oC-on, 7 napi inkubálást követően A képződött széles és kemény telepeket eltávolítjuk, majd homokkal és steril vízzel való összekeverés után 2 órára állni hagyjuk. A kész szuszpenzió LG közegen 2 különböző típusú telepet alkot: kicsi, bézs színű, N2 fixálásra nem képes telepeket, és nagy, barna N2-fixáló telepeket. A telepek számának meghatározása nem egyszerű, a legjobb becslést a Derxia-t tartalmazó talajszemcsék illetve gyökérdarabok aránya adja

Izolálási és azonosítási módszerek - Döbereiner Beijerinckia fajok izolálása és azonosítása: A Beijerinckia fajok a legjobban szilikagél lemezen izolálhatóak: Levegőztetett, finomra szitált (1 mm) talaj 20-100 mg-ját egyenletesen eloszlatjuk a lemezen 4-10 napos , 30 oC-on történő inkubálás után : A Beijernickia indica kisméretű, fehér telepeket képez, amik rövid időn belül széles, és ellenálló telepekké alakulnak A B.fluminense telepei kicsik, világos bézs színűek és szárazak A telepek számának meghatározása a talajban előforduló mikrotelepek alapján történhet, melyek 103-104 telepet alkotnak szilikagél lemezen

Azospirillum izolálása és azonosítása – Reinhold, Khammas és Döbereiner A módszer lényege: Az ide tartozó 5 faj felfedezése egy olyan nitrogénmentes félig szilárd közeg bevezetésének köszönhető, amelyen a mikroorganizmusok a közeg azon régiójába gyűlnek, ahol a légzési sebességük egyensúlyban van az oxigén diffúziós sebességével Nagyon jellegzetes fátyolszerű filmet képeznek 5 mm-re a felszíntől, majd a N2-függő növekedésük miatt egyre közelebb húzódnak a felszínhez, ahol egyre több sejt halmozódik fel, ezt használjuk ki az izolálási eljárás során. Szükséges készülékek és eszközök: 35 és 41 oC között szabályozható inkubátor Petri csészék Autokláv Tiszta munkafelület Steril üvegeszközök Mikroszkóp

Azospirillum izolálása és azonosítása – Reinhold, Khammas és Döbereiner Vegyszerek és oldatok I. : Azospirillum izoláláshoz szükséges (NFb) alapközeg: 5 g D,L- almasavat, 0,5 g K2HPO4-ot, 0,2 g MgSO4.7H2O-t, 0,1 g NaCl-t, 0,02 g CaCl2.2H2O-t, 2,00 ml „minor element” oldatot, 2,00 ml 0,5 %-os, 0,2 M-os KOH-ban oldott 0,5 %-os brómtimolkéket, 1,64%-os Fe EDTA oldatot, 1,00 ml vitamin oldatot és 1,75 g agar-agart feloldunk 800 ml desztillált vízben, KOH segítségével a pH-t 6,8-ra állítjuk, majd az oldatot desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel. Fontos, hogy az egyes komponenseket a megjelölt sorrendben adagoljuk, hogy elkerüljük a vas illetve más sok csapadékképzését. „Minor element” oldat: 0,40 g CuSO4.5H2O-t, 0,12 g ZnSO4.7H2O-t, 1,4 g H2BO4-ot, 1,00 g Na2MoO4.2H2O-t és 1,5 g MnSO4.H2O-t feloldunk 800 ml desztillált vízben, majd desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel. Vitamin oldat: 10 mg biotin, 20 mg pyridoxol- HCl és 100 ml desztillált víz keveréke

Azospirillum izolálása és azonosítása – Reinhold, Khammas és Döbereiner Vegyszerek és oldatok II. : Burgonya közeg: 200 g friss, hámozott burgonyát 30 percig 1000 ml desztillált vízben főzünk, majd pamutlapokon keresztül szűrünk. 2,5 g D,L-almasav, 2,5 g szacharóz és 15 g agar hozzáadása után a pH-t 6,8-ra állítjuk. Félig szilárd közeg az A. amazonese izolálásához (LGI) : 0,20 g K2HPO4-ot, 0,60 g KH2PO4-ot, 0,002 g CaCl2.2H2O-t, 0,20 g MgSO4.7H2O-t, 0,002 g Na2MoO4.2H2O-t, 0,01 g FeCl3-ot, 5 ml 0,2 M- os KOH-ban oldott 0,5 %-os brómtimolkéket, 5 g szacharózt és 1,8 g agar-agart feloldunk 800 ml desztillált vízben, majd desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel.

Azospirillum izolálása és azonosítása – Reinhold, Khammas és Döbereiner Az eljárás menete az A. brasilense, A. lipoferum és A. irakense izolálásához: a fentiekben ismertetett NFb (nitrogénmentes bázis) közeget 0,1 ml talaj vagy gyökér szuszpenzióval oltjuk be, majd 35, illetve az A. irakense esetében 30 oC-on inkubáljuk → 3-5 nap elteltével papírszerű fehér film képződik a közeg felületén A kinőtt baktériumkultúrát 15 g/l-es 0,02 g élesztőkivonatot tartalmazó NFb tápagarra átoltjuk → 1 hét elteltével kicsi, fehér és hullámos telepek figyelhetőek meg A különálló telepeket ezután új NFb közegbe helyezzük, majd tisztítjuk burgonyás közegbe való átoltással → 1 hét elteltével kicsi, rózsaszínes telepeket ismét áthelyezünk egy új NFb közegre oltjuk át, ahonnan a baktériumok már mikroszkóppal azonosíthatóak Az eljárás menete az A. halopraeferans esetében: Az eljárás itt is NFb közegben történik, de a pH-t 8,5-re kell beállítani, 1,2%-os NaCl hozzáadása szükséges, valamint az inkubálási hőmérséklet 41 oC

Azospirillum izolálása és azonosítása – Reinhold, Khammas és Döbereiner Az eljárás menete az A. amazonense izolálásánál: Ebben az esetben LGI közeget használunk, amin beoltás és 35oC-on történő inkubálás után 3-5 nap elteltével fehér film figyelhető meg A kinőtt baktériumkultúrát 20 g/l-es 0,02 g élesztőkivonatot tartalmazó LGI agarlemezekre átoltjuk → 5 nap elteltével kicsi, fehér és hullámos telepek figyelhetőek meg A különálló telepeket ezután új LGI közegre oltjuk át a savképződés nélküli nitrogénfüggő növekedés érdekében A tisztító szélesztést szacharózt és malátát tartalmazó burgonyás közegen végezzük → a képződő telepek fehérek, 5 mm szélesek és nagyban különböznek a előzőekben vizsgált fajok telepeitől

Endofita diazotrófok izolálása és azonosítása (Döbereiner, Cavalcante, Gillis, Reinhold-Hurek) A módszer lényege: A Herbaspirillum, Azoarcus nemzetségekhez tartozó fajok és az A. diazotrophicus obligát növényi endofiták, a növény belsejében élő baktériumok, ezért csak a gazdanövényből lehet őket izolálni Ehhez a tulajdonsághoz sokkal hatékonyabb biológiai nitrogénkötési képesség társul, ami pedig előny a növény növekedésében Szükséges készülékek és eszközök: 30 és 35 oC között szabályozható inkubátor Petri csészék Autokláv Tiszta munkafelület Steril üvegeszközök Mikroszkóp

Endofita diazotrófok izolálása és azonosítása (Döbereiner, Cavalcante, Gillis, Reinhold-Hurek) Vegyszerek és oldatok : Herbaspirillum spp., H. seropedicae és H. rubrisubalbicans izoláláshoz szükséges félig szilárd (JNFb) tápagar: 5 g D,L-almasavat, 1,5 g K2HPO4-ot, 0,2 g MgSO4.7H2O-t, 0,02 g NaCl2.2H2O-t, 2,00 ml „minor element” oldatot (lásd az Azospirillum részben), 1,00 ml vitamin oldatot (lásd az Azospirillum részben), 4 ml 1,64%-os Fe EDTA oldatot, 2 ml 0,2 M-os KOH-ban oldott 0,5 %-os brómtimolkéket és 2,0 g agar-agart feloldunk 800 ml desztillált vízben, a pH-t 6,0-ra állítjuk, majd az oldatot desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel. Fontos, hogy az egyes adalékokat a megjelölt sorrendben adagoljuk. Burgonya közeg: 200 g friss, hámozott burgonyát 30 percig 1000 ml desztillált vízben főzzük, majd pamutlapokon keresztül szűrjük. 2,5 g D,L-almasav, 2,5 g szacharóz és 15 g agar hozzáadása után a pH-t 6,8-ra állítjuk.

Endofita diazotrófok izolálása és azonosítása (Döbereiner, Cavalcante, Gillis, Reinhold-Hurek) Izolálási eljárás a Herbaspirillum fajok esetében: Mindhárom említett faj leginkább félig szilárd JNFb közeg gyökér-, vagy levélminta 10-2-10-6 hígítású szuszpenziójából identifikálható: A H.seropedicae fajok esetében bármilyen típusú Gramineae levél, a H.rubrisubalbicans fajoknál pedig cukornád beoltását követően vékony, az Azopirillum spp.-nél tapasztalt filmréteg figyelhető meg, ami ebben az esetben kisebb sejtekből (0,6-0,7 × 3-5 μm) áll Az izolálás 0,02 g élesztőkivonat és 4 ml brómtimolkék tartalmú NFb agarlemezen történik A képződő kicsi, nedves, fehér színű telepek közepe egy hét elteltével sötétkék színűvé válik A szacharóz és maláta tartalmú burgonyaagaron történő tisztító szélesztés apró, nedves, emelt telepeket eredményez, melyek közepe barnás

Endofita diazotrófok izolálása és azonosítása (Döbereiner, Cavalcante, Gillis, Reinhold-Hurek) Izolálási eljárás a Azoarcus fajok esetében: A félig szilárd NFb közegben történő izolálási eljárás megegyezik a Herbaspirillum fajok esetében ismertetett módszerrel A telepek szétoszthatatlan, sárgás pigmenteket képeznek a közeg felszínén, melyek etanol (mint szénforrás) alkalmazásánál még intenzívebbek Izolálási eljárás az Acetobacter diazotrophicus esetében: Az izolálás félig szilárd LGIP közegen történik : az A. amazonense fajok esetében ismertetett LGI közeg 100 g/l-re növelt szacharóz vagy cukornád koncentrációval, illetve 2,0 g agar koncentrációval A pH-t ecetsav segítségével 5,5-re állítjuk Ezt a közeget 0,1 ml cukornád szár- vagy levélmintával beoltva 4-6 nap elteltével megfigyelhető, hogy az eredetileg a felszín alatt található filmréteg a felszín felé mozog és sötét narancssárgás színt ölt Hasonló közegben 20 g/l-es agarlemezeken apró, nedves, sötét narancs színű telepek képződnek 1 hét elteltével A tisztítás ebben az esetben is burgonya közegen történik (maltóz helyett 10% cukornád tartalommal), amin 7 nap múltán sötétbarna, nedves telepek képződése figyelhető meg

Források J. Döbereiner: Enrichement, isolation and counting of soil microorganisms -Isolation and identification of aerobic nitrogen-fixing bacteria from soil and plants –In: Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Nitrogénkötő baktériumok izolálása dús füves területekről: http://www.fermentia.hu/pdf/nitrogenkoto.pdf Nitrogénfixáló baktériumok szerepe a tápanyagellátásban: http://www.greenpack.hu/agrobio_system.php?page=Bio-Nitro-Phos%20bakt%E9riumtr%E1gya Nitrogenáz és nitrogénfixálás: http://www.chem.science.unideb.hu/Oktatas/K3125/K3125Eload8.pdf A nitrogén körforgása: A biológiai nitrogénkötés - Putnoky: http://www.ttk.pte.hu/biologia/genetika/libr_gen/N2fix_1.pdf

Képek http://www.jircas.affrc.go.jp/english/publication/highlights/2003/2003-17.html http://www.maximumyield.com/article_sh_db.php?articleID=406