A polimeráz láncreakció Gurbi Bianka március 4. Emelt Biotechnológiai Számítások

Polimeráz láncreakció = PCR Célja: DNS molekulák felszaporítása in vitro Előnye: gyors, egyszerű Hátránya: minta előkészítése nehéz, időigényes lehet

A PCR reakcióelegy összetevői 1. DNS templát: bárhonnan izolálható, lehet a teljes genom, vagy annak egy részlete

A PCR reakcióelegy összetevői 2. DNS polimeráz: leggyakoribb a Taq polimeráz, illetve a Vent polimeráz hőstabilhőstabil gyorsgyors pontospontos

A PCR reakcióelegy összetevői 3. Primerek: rövid egyszálú DNS darabok, amelyek specifikusan kötnek a felszaporítani kívánt DNS két végéhez Forward primerForward primer Reverz primerReverz primer

A PCR reakcióelegy összetevői 4. Nukleotidok: dATP, dTTP, dGTP, dCTP 5. Puffer: pH beállítás, megfelelő enzimműködés biztosítása, DNS védelme

A PCR folyamatai 0. Elődenaturáció (95°C, 10 perc) 1. Denaturáció (95°C, 30-60s) 2. Annealing / összekapcsolás (10-20s) 3. DNS szintézis (72°C) 4. Ismétlés 5. Hűtés (4°C)

A PCR folyamatai

A PCR matematikai leírása Teljes DNS-lánc felszaporítási egyenlete: N=N 0 *2 n Egy DNS szakasz felszaporítási egyenlete: N=N 0 *2 n -2n

1. Példa Tekintsünk egyetlen DNS molekulát, amit felszaporítani kívánunk. Egy PCR során az általánosan alkalmazott ciklus szám 30. Hány molekulát kapunk, ha teljes DNS-t szaporítunk fel, és hányat, ha egy adott DNS szakaszt?

1. Példa megoldás N 0 =1, n=30 Teljes DNS-lánc felszaporítás esetén: N=N 0 *2 n =1*2 30 = Egy DNS szakasz felszaporítása esetén: N=N 0 *2 n -2n=1* *30=

A PCR matematikai leírása A reakció működése nem tökéletes, eltérések vannak az ideális esettől. Teljes DNS-lánc felszaporítási egyenlete: N=N 0 *E n Egy DNS szakasz felszaporítási egyenlete: N=N 0 *E n -Kn

2. Példa Tekintsük az első példa adatait, de vegyük figyelembe a PCR hibáit, vagyis a hatványalap legyen 1,8; a hozzátartozó lineáris szorzó pedig 1,9. Ekkor mennyi DNS keletkezik a két esetben? Hány százalékkal kevesebb DNS keletkezik ezekben az esetekben?

2. Példa megoldása N 0 =1, n=30, E=1,8K=1,9 Teljes DNS-lánc felszaporítás esetén: N=N 0 *E n =1*1,8 30 = Egy DNS szakasz felszaporítása esetén: N=N 0 *E n -Kn=1*1, ,9*30=

2. Példa megoldása Teljes DNS-lánc felszaporítása esetén: ( / )*100=4,24% Egy DNS szakasz felszaporítása esetén: ( / )*100=4,24%

Már egy DNS felszaporítása esetén is jelentős mennyiségű DNS keletkezik, még akkor is, ha a hatványalap eltér az ideálistól. A gyakorlatban eltekintünk ezektől a hibáktól. Elfogadjuk, hogy 30 ciklus alatt elegendő DNS keletkezik. A DNS pontos mennyiségét később határozzuk meg.

Agaróz gélelektroforézis Alapja az ionok elektromos térbeli mozgékonysága. Elektromos térbe helyezve a töltéssel rendelkező részecskék az ellenkező töltésű pólusok felé haladnak. Az ionok vándorlási sebessége, elmozdulása különböző, ezért lehetséges az elválasztásuk. A futtató közeg gél, amely poli-akrilamid vagy agaróz.

Agaróz gélelektroforézis Agaróz: a D-galaktóz és a 3,6-anhidro-L-galaktóz lineáris polimere. Egy lineáris DNS molekula vándorlási sebessége fordítottan arányos a molekula tömegének logaritmusával. A DNS pH 7 érték körül negatív töltésekkel rendelkezik, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé vándorol. Etídium-bromiddal festhető, UV-fénnyel detektálható.

3. Példa Adott agaróz gélelektroforézis gélfotója alapján határozzuk meg az ismeretlen DNS fragment nagyságát!

3. Példa megoldása Első lépésként szükségünk van az alkalmazott marker adataira, amelynek segítségével az adott gélre megadhatjuk a futási távolság – bázispár szám összefüggést, végeredményben a kalibrációs egyenest.

3. Példa megoldása Az alkalmazott DNS létra adatai: Ez alapján a marker vonalai beazonosíthatóak. Következő lépésben meg kell határozni a futási távolságot (vonalzó).

3. Példa megoldása Az adatokat Excelben rögzítjük, diagramban ábrázoljuk. A kapott pontokra egyenest illesztünk, feltüntetjük az egyenes egyenletét, valamint a varianciát.

3. Példa megoldása A kapott kalibrációs egyenes: y = -0,1385x + 4,1411

3. Példa megoldás Végül meghatározzuk a minta futási távolságát: x=7,1 cm. A kalibrációs egyenes egyenletébe behelyettesítve kiszámítjuk a lg(bp) értéket, abból pedig a bázispárszámot: y=-0,1385x+4,1411=-0,1385*7,1+4,1411y=3,16=lg(bp) bp=1438

Real-time PCR A PCR folyamatának valós idejű nyomon követése. Leggyakoribb detektálási technikák: SYBR Green I. festék (duplaszálú DNS-hez kötődik, fluoreszcens jelet detektálnak)SYBR Green I. festék (duplaszálú DNS-hez kötődik, fluoreszcens jelet detektálnak) FRET (hibridizációs próbák)FRET (hibridizációs próbák)

Real-time PCR - FRET Fluorescence Resonance Eneregy Transfer

A real-time PCR hatékonysága Különböző kiindulási koncentrációkban vesznek DNS-oldatokat, és legalább annyi cikluson keresztül futtatják a PCR-t, amíg el nem érik a kimutatási határt, ahol a fluoreszcens jel már detektálható.

A real-time PCR hatékonysága N=N 0 *E n lgN=lgN 0 +n*lgE -n*lgE=lgN 0 -lgN n=-(1/lgE)*lgN 0 +lgN/lgE

A real-time PCR hatékonysága Tehát ha lgN 0 függvényében ábrázoljuk az n értékeket (az a ciklusszám, ahol elérték a kimutatási határt), akkor egy egyenest kapunk, aminek a meredeksége -1/lgE, a tengelymetszete lgN/lgE. Tehát megkapjuk a PCR amplifikációs hatékonyságát (E), valamint a végső DNS mennyiségét (N).

A real-time PCR hatékonysága Áttörési ciklusszám Kiindulási DNS mennyisége (lgN 0 )

4. Példa Real-time PCR hatékonyságát vizsgálták. Ehhez 10 3, 5*10 3, 10 4, 5*10 4 és 10 5 kezdeti DNS koncentrációkból indultak ki. Fluoreszcens jelüket vizsgálva sorban a következő ciklusszámokat kapták: 35, 33, 32, 30 és 28. Határozzuk meg a végső DNS koncentrációt és a hatékonyságot!

4. Példa megoldása Először írjuk fel az adatokat Excelben. Vegyük a kezdeti DNS koncentráció logaritmusát. Ábrázoljuk az adatokat egy diagramban, majd a pontokra illesszünk egyenest.

4. Példa megoldása Az egyenes egyenlete: y = -3,3522x + 45,276 Itt y=n az áttörési ciklusszám, x=N 0. A meredekség: -3,3522=-1/lgE E=10 (-1/-3,3522) =1,99 A tengelymetszet: 45,276=lgN/lgE=lgN/1,99 N=10 (45,276*lg1,99) =3,4*10 13 A kapott értékek jellemzőek egy adott PCR lefutására.

PCR alkalmazásai Molekuláris klónozás alternatívája Molekuláris klónozás alternatívája Genetikai betegségek felderítésére, fertőző betegségek diagnosztizálására, bűnözők azonosítására, apasági vizsgálatok Genetikai betegségek felderítésére, fertőző betegségek diagnosztizálására, bűnözők azonosítására, apasági vizsgálatok Detektálhatóak a kapcsolt gének csoportjai Detektálhatóak a kapcsolt gének csoportjai Összekapcsolható reverz transzkriptáz reakcióval: mRNS-ek ezen keresztül mikroorganizmusok aktivitásának mérése Összekapcsolható reverz transzkriptáz reakcióval: mRNS-ek ezen keresztül mikroorganizmusok aktivitásának mérése

PCR alkalmazásai Környezeti minták vizsgálata Környezeti minták vizsgálata Speciális enzimek termelődésének vizsgálata Speciális enzimek termelődésének vizsgálata Újabban fehérje PCR! Újabban fehérje PCR!

Köszönöm a figyelmet!