FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA

A humorális immunválasz szakaszai Felismerés Aktiváció: B sejt proliferáció és differenciáció Antitest szekréció Helper T sejtek, egyéb stimulusok Klonális expanzió Izotípus váltás Nyugvó IgM+, IgD+ érett B sejtek Aktivált B sejtek Affinitás érés Memória B sejtek

A T sejt válasz szakaszai Antigén felismerés Aktiváció Klonális expanzió Differenciáció Effektor funkciók Macrophagok, B sejtek, aktiválódása Fertőzött target sejtek ölése; macrophag aktiváció IL-2 is the main AUTOKRINE growth factor for T-cells. High affinity IL-2 Rec also upregulated. A similar APC-produced cytokine, IL-15, stimulates proliferation of CD8+ cells, especially memorycells of the CD8+ subset. BEFORE ANTIGEN EXPOSURE: the number of spec. clones is one in 105-106 lymphocytes. AFTER clonal ecpansion this ratio may be 1:10 for CD8+ and 1:100 to 1: in 1000 for CD4+ T-cells Lymphoid szövet Perifériás szövet

B sejt receptor szignál Antigén keresztköti a membrán IgG-t Tirozin foszforilációs események PLCγ aktiváció GTP/GDP csere a Ras, Rac-on Biokémiai intermedierek IP3 Emelkedett Ca++ a citoszolban Ras-GTP Rac-GTP Aktív enzimek Ca++ függő enzimek Ser/thr kináz Transzkripciós faktorok

T sejt receptor komplex általi szignalizáció A TCR-mediált szignaling kezdete PLCγ aktiváció Biokémiai intermedierek Emelkedett Ca++ a citoszolban Disztális szignál enzimek (Protein Páz)-IL2 válasz) Transzkripciós faktorok

A B-sejtek T-sejt függő aktivációja és a T sejtek APC általi aktivációja szinte mindegyik lépés gátolható A gátlás következményeiből következtethetünk az aktivációs folyamatok mikéntjére.

A sejtfunkciók gátlása a klinikai gyakorlatban - immunszuppresszió gyulladások (bőrgyógyászat, tüdőgyógyászat, stb.) transzplantáció allergiás kórképek autoimmun betegségek Használt hatóanyagcsoportok/technikák Kortikoszteroidok citosztatikus anyagok (alkilálószerek (CP,klorambucil), folsavantagonisták (MTX), purin-/pirimidin-szintézis gátlói-AZA) Nem citosztatikus hatású immunszuppresszív szerek (cyclosporin A, tacrolimus/sirolimus, leflunomide) citokin-receptor elleni antitestek, blokkoló citokin-elleni antitestek Leukaferezis Nagy dózisú iv. immunglobulin (IVIg)

(glukokortikoid recognition element) Kortikoszteroidok Glükokortikoid R GRE (glukokortikoid recognition element) (NF-κB, AP-1) PLA2 gátlása – arachidon(sav) anyagcsere gátlás csökken az IL-1, TNF-α, IL-4, és más citokinek szintézise

Glukokortikoszteroidok hatásai az immunrendszer elemeire célsejtek hatás T sejtek lympholysis, citokintermelés gátlása B sejtek minimális hatása van az Ig termelésre Makrofágok Az MHCII expresszió gátlása, citokin termelés gátlás, prosztaglandin termelés és felszabadulás gátlása Neutrofil granulociták Adhézió gátlás Eozinofil, bazofil, és hízósejtek Eosinopenia, a degranuláció gátlása Endothelium Adhéziós molekulák expressziójának gátlása, PGE termelésének és felszabadulásának gátlása Fibroblasztok PGE termelés és felszabadulás gátlás

Kortikoszteroidok megbízható hatás, megbízható mellékhatások Szisztémásan adott szteroidok mellékhatásai, a teljesség igénye nélkül: Elhízás (centrális típusú) Növekedési visszamaradás gyermekkorban Fogékonyság fertőzésekre Thrombosishajlam, coronariabetegség kockázata nő Elhúzódó sebgyógyulás, fekélyek kialakulás Gyomorfekély Osteoporosis, asepticus csontnecrosis, szteroidmyopathia Hypertonia Hirsutismus, bőr atrophia, szteroid acne Glaucoma, cataracta Psychés zavarok Rendszabályok: szigorú dózishatárok, alternáló adagolás, fokozatos leépítés Lokális alkalmazás: kevesebb (elhanyagolható) mellékhatás!

Immunfunkció gátlás citosztatikumok Az immunsejtek proliferációjának gátlásával is immunszuppresszió érhető el: citosztatikumok Tumorterápiás szerek, amik a limfociták osztódásának a gátlásához is felhasználhatóak, de némelyik igen súlyos mellékhatások árán. alkiláló szerek (cyclophosphamid, chlorambucil) purinbázisokhoz kötödő, DNS-replikáció gátlók; hatékonyak, de súlyos mellékhatások árán, pl. szinte biztos leuko- és lymphopaenia folsavantagonisták (methotrexát) nukleinsav szintézis gátló, szükség esetén folsav támogatást igényel; hepatotoxikus (májenzimek időszakosan ellenőrzendők!) purin antagonisták (6-merkaptopurin, azathioprin, mikofenolát mofetil) purin szintézis gátlás – a T- és B-sejtek nem rendelkeznek megkerülő, „salvage” purinhasznosító útvonallal, csak de novo szintézisre képesek pirimidin antagonisták

Immunofilin gátlószerek („kalcineurin inhibitorok”) Cyclosporin A – 11 aminosavas ciklopeptid (Tolypocladium inflatum talajlakó gomba termeli) ciklofilinekhez kötődik, amelyek így nem tudják aktiválni a calcineurint, nincs NF-AT aktiváció  gátolt az interleukin szintézis (főleg T-sejt eredetű IL-2) Tacrolimus (FK506) – ciklosporin hatású, nagyméretű gyűrűs vegyület, makrolid antibiotikum (Streptomyces tsukubaensis – baktérium termeli, 'Tsukuba macrolide immunosuppressant‘) A tacrolimus előnye, hogy a bőrön át is felszívódik, így atópiás dermatitisben lokálisan használják. Sirolimus (rapamycin) Streptomyces hygroscopicus – (Rapa Nui avagy Easter Island - Húsvét szigetekről származó mikroba termeli)

Citotoxikus és blokkoló antitestek: CD3(OKT-3), CD4, CD2, CD7, CD25, HLA-DR Otelixizumab/visilizumab, alefacept (aCD2), Rövid távú tapasztalatok vannak ezzel a technikával, a korai xenogén (ált. egér) antitesteket felváltották a kiméra, majd a humanizált antitestek. Utóbbiak <5% egér eredetű komponenst tartalmaznak, így a hatásukat semlegesítő antitestválasz ritkább. További lehetőség: toxinokkal/izotóppal konjugált antitestek célzott sejtpusztításra (pl. Zevalin - ittrium-90) Anti-citokin antitestek: Anti-TNFα-antitestek RA infliximab, adalimumab szolubilis TNFα-rec. (etanercept - Enbrel)  RA, JCA (2006 óta törzsk.) anti-IL2  transzplantáció FTY720 (fingolimod) Isaria sinclairii gomba termeli, a limfocita adhéziót befolyásolja az α4/β7 integrinen keresztül. Hatására a limfociták száma lecsökken a keringésben és a nyirokcsomókban akkumulálódnak. (phase III clinical trials) Leflunomid Hatása a rapamycinhez hasonló, DMARD („disease modifying antirheumatic drug”)-ként 2005 óta törzskönyvezett RA-ban és arthritis psoriaticaban dihydroorotate dehydrogenase gátlás

Az antigén-specifikus T és B sejtek gyakorisága kicsi. A poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagok, és módszerek hasznosak lehetnek a sejtek funkcionális vizsgálatában.

Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi. Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.

A T- ÉS B-LIMFOCITÁK FUNKCIONÁLIS AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával lektinek (PHA, ConA) által indukált aktiváció anti-IgM, anti-CD3 vagy anti-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek intracelluláris események vizsgálata proliferatív válasz ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után ELISPOT intracelluláris citokin jelölés pentamer (vagy tetramer) technika

A LIMFOCITÁK POLIKLONÁLIS AKTIVÁCIÓJA LPS, LEKTINEK, PMA+IONOMYCIN JELENLÉTÉBEN B-sejt (egér) T-sejt T-sejt TLR4 Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák

Poliklonális T sejt aktivátorok Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai Aktivátor T-sejt függés Ig szekréció Humán B sejt PWM (pokeweed mitogen) nincs van SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) EBV (transzformáló hatású is) Anti-Ig citokinek jelenlétében Egér B sejt LPS PWM PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) pokeweed - Phytolacca americana (Álkörmös) Poliklonális T sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis Concanavalin A (ConA) Phaseolus vulgaris anti-CD3 Monoklonális ellenanyag

Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) – formerly used for coloring red wine (toxic: triterpene saponin) Chenopodiales Phytolaccaceae

Phytohaemagglutinin (PHA)  Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean

Concanavalin A (ConA)  Phaseolus vulgaris – bean