Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„Scaffold”-ok előállítása Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 9. Előadás „Scaffold”-ok előállítása

„Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok I. Biokompatibilitás – immunreakciók elkerülése Felszíni kémia – sejtfunkciók támogatása Egymással összeköttetésben lévő pórusok kialakítása – sejtek egyenletes eloszlásának és erek képződésének támogatása Ellenőrzött biodegradáció – az új szövet kialakulásának lehetővé tétele

„Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok II. Mechanikai tulajdonságok – a szerkezet és funkció stabilitása a beültetés után illetve a szöveti újraképződés során Lehetőség különböző gyógyszermolekulák illetve bioaktív anyagok beágyazására és szabályozott felszabadulására ECM interakció – beültetés után az ECM kialakulásának támogatása Beültetés után az ECM helyettesítése

A „scaffold”-ok tulajdonságainak jelentősége Biztosítják a sejtek számára a 3D környezetet Beültetés után átmenetileg az ECM-t helyettesíti Közvetlenül irányítják a sejtek differenciálódását Szerkezetük meghatározza az előállított szövetkonstrukciók tápanyagellátását

Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) I. Az oldószerben feloldott „scaffold”-anyagot pórusképző részecskékkel töltött öntőformába öntik Oldószer elpárologtatása Pórusképző részecskék kioldása „Scaffold” bevonat: az öntőformát a feloldott „scaffold” anyagba mártják Egyszerű, könnyű, olcsó technika Nem igényel speciális laboratóriumi felszerelést A használt szerves oldószerek gyakran mérgezőek, maradványaik nehezen eltávolíthatóak

Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) II. Oldószer Öntőforma Porogén Polimer Porózus szerkezetet kapunk Oldószer elpárologtatása Porogén kioldása

Fázis szeparációs módszerek A polimert két, egymással nem elegyedő oldószer keverékében oldják fel A telített oldatot melegítik A magas illetve alacsony polimer- tartalmú fázisok elkülönülnek egymástól A hőmérséklet csökkentésével a polimer kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból Az oldószert eltávolítják (kivonás, elpárologtatás, szublimáció)

Magasszintű technikák Gázhabosítás Speciális felszerelést igényel A „scaffold” anyagát nyomásálló kamrába töltik A „scaffold” anyagát szuperkritikus állapotú széndioxidban „oldják” fel A hőmérséklet csökkentésével gáz halmazállapotúvá válik A fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer 10 000 1 000 100 10 1 200 250 300 350 400 Hőmérséklet T (K) Nyomás P (bar) szilárd folyadék gáz kritikus pont szuperkritikus állapot hármas pont

Polimer vagy kompozit oldat Elektroszövés I. Injektor Polimer vagy kompozit oldat Fémtű Magasfeszültségű áramforrás Elektromosan töltött szál V Gyűjtőlemez

Elektroszövés II. Speciális felszerelést igényel Sokoldalú, flexibilis technika Nincs szükség extrém körülményekre (hő, koaguláció) Többféle polimer használható, pl.: PLA, PLGA, selyem fibroin, chitosan, kollagén Szálvastagság, pórusméret, szálorientáció könnyedén szabályozható

Magasszintű technikák Szövött biotextíliák Speciális felszereltséget igényel Az így előállított „scaffold” szabályos, szövött szálakat tartalmaz 2D illetve 3D „scaffold” szerkezet is előállítható A pórusméret könnyen szabályozható Sokoldalú technika, a „scaffold” anyag széles körben alkalmazható és kombinálható

Szövött biotextília

Magasszintű technikák Spontán „összeszerelődés” Spontán „összeszerelődés” a molekulák spontán összeállása rendezett struktúrává Oldott állapotban az amfofil peptidek nem-kovalens kötésekkel összekapcsolódnak

Amfofil peptidek tervezése Foszfoszerin-csoport serkenti a mineralizációt (csontszövet előállításánál) RGD motívumok segítik az adhéziót (integrin-kötőhelyek biztosítása) Ciszteinek a molekulák közötti keresztkötések létrejöttét teszik lehetővé GGG összekötő-motívumok a feji és farki rész között növelik a molekuláris szerkezet rugalmasságát

Magasszintű technikák Automatikus gyártási technológiák „Rapid prototyping”: adott szerkezetű tárgy automatizált előállítása additív technológia felhasználásával Gyors technológia, mely azonos minőségű, szerkezetű, mintázatú „scaffold”-ot eredményez Drága módszer, számítógép vezérelt készüléket igényel

Magasszintű technikák Fused deposition modeling (FDM) Robotikusan vezérelt készülék Polimer vagy más anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen keresztül több rétegben Szilárd felületre vagy „Vonalkázva”: ekkor a később eltávolításra kerülő részekhez más anyagot használnak

Magasszintű technikák Selective laser sintering (SLS) A kicsivel az olvadáspontja alatt tartott, por vagy granulátum formájú „scaffold” anyagból egy réteget terítenek le (előreprogramozott minta szerint) A számítógép-vezérelt lézersugár felmelegíti az anyagot, amely ennek hatására összeáll (összeolvad anélkül, hogy megolvadna) Újabb réteget fektetnek le és olvasztanak össze A tárgy 3D szerkezete így rétegenként épül fel

Selective laser sintering (SLS) 1 „Scaffold” anyagot mozgató rendszer 2 3 Szkenner Lézer „Scaffold” réteg Éppen készülő tárgy Roller Dugattyú Dugattyú Dugattyú 4 5 6 7

Biokompatibilitás Dr. Pongrácz Judit Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 10. Előadás Biokompatibilitás

Biokompatibilitás - Definíció Az anyag azon képessége, hogy a befogadó szervezetben az alkalmazásának megfelelő választ vált ki. A biokompatibilitás a TE termékek előállításához használt „scaffoldok” vagy mátrixok azon képessége, hogy olyan szubsztrátként viselkednek, amely támogatja a megfelelő sejtműködést, vagyis megkönnyíti a molekuláris és mechanikai jelátviteli rendszerek működését az optimális szövetregeneráció érdekében, DE sem az adott sejtekben, sem pedig lokálisan vagy szisztémásan nem idéz elő nem kívánt válaszreakciót.

Biokompatibilitás - Jelenlegi nézetek Régi koncepció: olyan bioanyagok használata, melyek nem lépnek interakcióba a befogadó szervezet („host”) szöveteivel A bioanyag-tervezés új célkitűzései: A bioanyagok aktív módon interakcióba lépnek a „host” szöveteivel Pozitív élettani választ váltanak ki Támogatják a sejtek növekedését és differenciálódását

Bioanyagok biokompatibilitása A természetből származó anyagok természetüknél fogva biokompatibilisek (pl.: kollagén, fibrin, hyaluronsav) A xenogén bioanyagokat a biokompatibilitás eléréséhez módosítani kell (pl.: borjúkollagén humán felhasználása előtt az immunogén szekvenciákat el kell távolítani emésztéssel) Már rekombináns humán kollagén is kapható Más xenogén anyagok (pl.: növényi eredetű poliszacharidok) biokompatibilitását tesztelni kell Szintetikus anyagoknál szintén ellenőrizni kell azok biokompatibilitását

Biokompatibilitás - Terminológia Biodegradálhatóság: in vivo makromolekuláris degradáció; a lebomlási termékek nem eliminálódnak a szervezetből Bioabszorbeálhatóság: a makromolekuláris komponensek az anyagcsere megváltozása nélkül jutnak be a szervezetbe Biológiai felszívódóképesség: a makromolekuláris alkotóelemek lebomlása és metabolizálódása, a molelulatömeg csökkenése, a végtermék kiválasztása

Biokompatibilitás tesztelése A vér/anyag vagy szövet/anyag határfelületnek a lehető legkisebbnek kell lennie Álljon ellen a biodegenerációnak Fontos, hogy a bioanyag természetes anyagként viselkedjen vér és szövet jelenlétében. A beültethetőséget kizárja, ha az anyag: Vérrögképződést indít el (Trombózisveszély) Károsítja vagy szenzitizálja a vér sejtes elemeit Megváltoztatja vérplazma fehérjéit (köztük enzimeket) nem kívánt reakciókat előidézve Káros immunreakciót indít el Rákot okoz Teratogén Toxikus vagy allergiás választ vált ki Elektrolitvesztést okoz Sterilizálás hatással van rá

Inkompatibilitás miatt fellépő komplikációk A beültetett anyag elleni immunreakció Krónikus gyulladás Hegszövet képződés Fokozott véralvadás (érgraft inkompatibilitás) Graft elégtelenség Kilökődés

Normál sebgyógyulás A sebgyógyulás több fázisra osztható, az egyes szakaszokra a bennük szerepet játszó sejtpopulációk illetve sejtfunkciók egyaránt jellemzőek: Véralvadás Gyulladás Sejtek inváziója és szöveti újraképződés

Idegentest reakció I. Az implantátum jelenléte megváltoztatja a gyógyulási folyamatot, ez az un. idegentest reakció (Foreign Body Reaction, FBR), részei: Fehérje adszorpció Makrofágok Sokmagvú idegentest óriássejtek Fibroblasztok Érképződés Az implantátum folyamatos jelenléte egy végső készenléti állapot eléréséhez vezethet (resolution). Az implantátum sorsa ezután a következő 3 folyamat egyike lehet: Reszorpció Integráció Enkapszuláció (fibrózis)

Idegentest reakció II. Az abszorbeált plazmafehérjék granulocita és makrofág választ indítanak el A frusztrált fagocitózis a makrofágok aktivációjához és óriássejtek képződéséhez vezet Bioanyag Monociták Makrofágok Ér Endotél Sejt-vándorlás Fibroblasztokat és kollagént tartalmazó réteg Makrofágokat Idegentest típusú óriássejtek

Bioanyagok Ideiglenes implantátumok: A szöveti regeneráció és gyógyulás átmeneti segítése Csont graftok, biológiailag felszívódó sebészeti varratok Állandó implantátumok: Hosszú távú fizikai integritás és mechanikai teljesítmény Szervműködés hosszú távú helyettesítése Műbillentyűk, ízületek, stb.

Biológiailag inert anyagok Poli-tetrafluor-etilén (PTFE, Teflon®): A szervezet számára inert Rendkívül alacsony súrlódási együttható (0,05-0,10 a polírozott acélhoz képest) Biológiailag inert, az élő szövetekkel nem lép interakcióba Ízületi protézisek valamint műbillentyűk felszínének borítására használják

Szilikon származékok A szilikonok olyan polimerek, amelyek a biokompatibilis polimerek által általánosan tartalmazott C, H, N, O elemek mellett Si-t is tartalmaznak A szilikonok gyógyászati osztályozása: nem beültethető, rövid- illetve hosszútávra beültethető szilikonok Katéterek, csövek, mellimplantátumok, óvszerek előállításához

Biokompatibilis fémek Titánium ötvözetek ízületi protézisekhez és fogpótlásokhoz Kitűnő mechanikai sajátságok Nem toxikusak, és nem lökődnek ki Egyedülálló osseointegrációs képesség A beültetést megelőzően alkalmazott hidroxiapatit borítás elősegíti az osseointegrációt

Hidroxiapatit kerámiák A hidroxiapatit (HA) természetes állapotban a csontokban és a fogakban megtalálható HA kristályokat gyakran más polimerekkel kombinálják a „scaffold” előállítás során Mikrokristályos HA táplálékkiegészítőként is kapható a csontritkulás megelőzésére Jobb, mint a CaCO3 az oszteoporózis megelőzésében

Poli-a-hidroxi-savak: bioabszorbeálható polimerek Leggyakrabban használt bioanyagok Fő felhasználási terület: felszívódó varratok, gyógyszerhordozó „scaffold”- ok, ortopédiai protézisek Poliészter láncok Egyszerű hidrolízissel történő biodegradáció A keletkező a-hidroxi-savak különböző anyagcsereutakon át eliminálódnak (pl.: citromsav ciklus) vagy módosítás nélkül a vizelettel távoznak

Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja I. H2O (CH2)nCO(CH2)n C O HO(CH2)n CO O + (CH2)COH O Poliészter Hidroxi-terminális Karboxi-terminális Leggyakrabban használt poli-a-hidroxi- savak: Poli-tejsav (PLA) Poli-glikolsav (PGA) Poli-kaprolakton (PCL) Degradációs termékeik a citrátkörbe lépnek be

Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja II. Észteráz H2O PHB b-Hidroxi-butirát Szerin Glicin Glikolsav PGA H2O PDS Piruvát Tejsav PLA CO2 H2O Acetoacetát Acetil-KoA PGA = poli-(glikolsav) PLA = poli-(tejsav) PDS = poli-(d-dioxán) PHB = poli-(hidoroxi-butirát) Vizelet Citromsav Citrátkör CO2 H2O Oxidatív foszforiláció ATP

Poli-a-hidroxi-savak felhasználása Típus Polimer Jelenlegi felhasználás Poliészter Politejsavak Poli-(L-tejsav), [PLLA] Poli-(D, L-tejsav), [PDLLA] Felszívódó varratok Csontprotézisek Csont-, máj- és idegszövet konstrukció számára „scaffold”-ként Gyógyszerhordozóként (többféle) Tejsav-glikolsav kopolimer, [PLGA] Szabályozott hatóanyag-leadási rendszerként (fehérjék és kismolekulájú gyógyszerek) TE „scaffold” Génátvitel Poli-(ε-kaprolakton), [PCL] Lassú szabályozott hatóanyag-leadási rendszerként – gyógyszerhordozóként (pl.: > 1 év)

Poli-(Glikolsav), (PGA) PGA merev, erősen kristályos anyag Kizárólag erősen apoláros szerves oldószerekben oldódik Főként felszívódó varratokban használják (Dexon®) SCPL technikával „scaffold” előállítás Tömeg-degradáció Természetes lebomlási termék (glikolsav)

Poli-(tejsav), PLA és PGA kopolimerek D, L izoformák és racémek keverékei Leggyakrabbab az L izoformát használják együtt PGA-val: PLGA kopolimer PLGA egyike azon kevés polimernek, amelyet humán felhasználásra fejlesztettek ki PGA és PLLA kopolimerjei széles körben felhasználhatóak A degradáció sebessége illetve típusa a kopolimer összetételétől függ

Politejsavak biodegradációja Általános lépés az észterkötések random hidrolízise A degradáció típusa és sebessége az összetételtől függ A lebomlási termékek nem toxikusak, nem váltanak ki gyulladást Nagyméretű ortopédprotézisek esetén azok savas degradációja toxikus termékeket eredményezhet Kisebb darabok törhetnek le az implantátumról, melyek gyulladást okozhatnak

Poli-(kaprolakton), (PCL) Szemikristályos polimer Nagyon lassú degradáció (a tiszta PCL 3 év alatt bomlik le, más kapronokkal alkotott kopolimerjei könnyebben degradálódnak) Hosszabb távú gyógyszerhordozásra használják A PCL-t biokompatibilis, nem toxikus anyagként tartják számon

Polimer erózió A víz beszivárog az anyagba, a polimer amorf fázisának kémiai kötéseit hasítja, így a hosszú polimerláncokat rövid vízoldékony darabokra bontja. Ennek következtében a molekulatömeg csökken, a fizikai tulajdonságok viszont nem változnak, hiszen a kristályos fázisok összetartják a polimert. A víz átjárja az anyagot, és a fragmensek metabolizálódását és tömegerózióját indítja el. A polimer felületi eróziójáról akkor beszélünk, ha a polimer gyorsabban alakul át vízoldékony anyagokká, mint ahogy a víz beszivárog a konstrukcióba.

Bioanyagok degradációjának típusai Felületi erózió Tömegerózió Degradáció Idő

Degradáció I. Biológiailag lebomló hidrogélek: a vízoldékony polimerláncok közötti kémiai keresztkötések hasítása Felületi erózió a jellemző A tömegveszteség lineáris a degradáció során

Degradáció II. A polimerlánc hasítása vízoldékony monomereket eredményez CH3 CH3 CH3 H2O −(CH − C − O − CH − C − O −)x−(CH2 − C − O − CH2 − C − O)y− −HO − CH − C − OH + OH − CH2 − C − OH O O O O O O Krebbs ciklus CO2 + H2O

Degradáció III. Polimer hidrofóbicitás: a hidrofóbicitás növekedése nagyobb stabilitást eredményez Bulky szubsztitúciós csoportok (pl.: metil-csoport PLA esetén) növeli a degradációs időt (PGA<PLA) Üvegesedés: Az üvegesedési hőmérséklet (Tg) felett a rugalmassá váló polimerek láncai mozgékonyabbak, így a víz számára könnyebben hozzáférhetőek Kristályos szerkezet csökkenti, az amorf struktúra növeli a degradáció időtartamát