Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária A humán genom projekt 2.

Hogyan találjuk meg a géneket? A “hasznos információ” - hány génünk van? Kb. 40,000 - 60,000 fehérje kódoló gén (sokkal kevesebb, mint amennyit vártunk) vagyis a gének a genom kevesebb mint 5%-át foglalják el….. Hogyan találjuk meg a géneket?

Rövid másolatok (150 -400 bp) PCR reakcióval: Gén = az az információ, amely az egyes szövetekben kifejeződik (expresszálódik) Kiindulási pont: Az agy (és más szövetek) mRNS információtartalma (cDNS) Rövid másolatok (150 -400 bp) PCR reakcióval: Craig Venter Random primer

EST = expressed sequence tag Olyan rövid DNS szekvencia részletek, melyek kifejeződnek (az agyban ill. máshol) EST könyvtár Az agyban (ill. más szövetekben) kifejeződő gének azonosítására alkalmas

2. Hol van az EST a humán genomban? ‘in silico’ keresés BLAST – Basic Local Alignment Search Tool 1. EST -k szekvenálása 2375 agyi EST szekvenálása + BLAST 3. Gének azonosítása, új gének felfedezése < 400 ismert gén Közel 2000 új gén felfedezése

Celera, 2001: kb. 30 000 EST kb. 35 000 humán gén A gének könyve

Gének azonosítása ‘in silico’ Mi jellemző a génre: 1. Start jel (start kodon) 2. Stop jel (stop kodonok) NE LEGYENEK SŰRŰN! 3. Exon/intron átmenet: jellemző szekvenciák Kereső programok pl. ORF (NBCI)

ORF= open reading frame =„Olvasási keret” 1 2 3 GTGCGTGAGC GTGGCCACCG AGCGCGCCCT GCAGACGCCC ACCAACTCCT TCATCGTGAG CCTGGCGGCC GCCGACCTCC TCCTCGCTCT CCTGGTGCTG CCGCTCTTCG TCTACTCCGA GGTGAGCCGC GTCCGGCCGC ACGAGCATCC TCACCTGCTC 6 5 4

NCBI ORF finder: „Olvasási keret kereső” http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

Transzkripciós faktorok 5’ nem kódoló régió 1 kódoló régió promoter DNS TATA GC GT DNS-dep. RNS-pol. II. Transzkr. F. (FEHÉRJÉK) enhancer / silencer szekvenciák Zn2+ Y C F L H ... Sp1 TATA-box: TATA A A T GC-box: GGGGCGGGG GT/CACC-box: GGTGTGGG TATA GC GT

DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálat Gél retardáció Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

* * EMSA Hagyományos elektroforézis START DNS-fehérje komplex Szabad DNS darab (jelölt oligo) *

* * EMSA Kapilláris elektroforézis gyorsabb lassabb 2 4 6 8 perc DNS-fehérje komplex * Szabad DNS darab (jelölt oligo) * gyorsabb lassabb 2 4 6 8 perc

Specifikus-e a DNS-fehérje kötődés ? Kompetíciós (versengési) kísérletek A jelölt oligo a „próba” „vad típusú próba” 5’– F –CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’ „specifikus kompetitor” A nem jelölt oligo a „kompetitor” 5’–CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’ „nem-specifikus (mutáns) kompetitor” 5’–CCCTTGGTGGGTTGGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCAACCCCGGGATTCGACGC–5’

EMSA: A specifikus kötődés igazolása Spec. Komp. + + Nem spec. komp. 1 2 3 DNS- fehérje komplex látjuk 3 nem látjuk 2

EMSA: A specifikus kötődés igazolása: supershift ellenanyag + + Spec. ellenanyag antipeptid 1 2 3 DNS- fehérje komplex * 3 + még lassabb „supershift” 2

Rekombiáns DNS technológia a gyógyszeriparban Humán rekombináns fehérjék előállítása gyógyászati célra

Rekombináns gyógyszerek tPA trombózis VIII. faktor hemofilia CSF (colony stimulatong factor) immundeficiencia eritropoetin anemia hGF (growth factor) hGF hiány (növekedési rendellenesség) inzulin diabetes interleukin immunodeficiencia VACCINÁK Pl. hepatitis B FEHÉRJÉK ipari előállítása ?

Humán génexpresszió Prokariótákban Expressziós vektorok A humán gén “háziasítása” - csak exonok (cDNS) - bakteriális promoter - bakteriális riboszóma kötőhely Az idegen fehérje expressziójának ki/be kapcsolása Represszor fehérje ProK DNS lac promoter lac operátor Humán fehérje cDNS +IPTG indukció expresszió

Inzulin: Az első engedélyezett rekombináns gyógyszer 1. Vektor konstrukció promoter operátor AmpR ori lacZ (b gal) Inzulin A vagy B lánc (inszert) Mesterséges “ inzulin gén” Aminósav szekvencia  bázisszekvencia

2. Bakteriális transzformáció, AmpR klónok szelektásása és klónozása E. coli Bakteriális kromoszóma lac represszor AmpR plazmid 3. Fúziós fehérje termelése IPTG adásra 4. Lízis, fehérje izolálása, tisztítása 6. A és B lánc in vitro egyesítése bgal inzulin 5. CN Br kezelés: Metionin lebomlik, inzulin felszabadul

Met-hiányos hGH bakteriális expressziója 1. Vektor konstrukció hGH Bakteriális szignál szekvencia (extracelluláris) AmpR 1. Transzformáció szelekció növesztés 2. hGH szekréció a periplazmás térbe 3. Bakteriális periplazmás proteáz: levágja a szignál szekvenciát 4. Met-nélküli rec hGH tisztítása

Riporter gének EuK sejt sejtmag Virus-vektor-riporter gén konstruktum Expresszió mérés a riporter fehérje alapján Riporter rendszerek luciferáz ATP  ADP + Pi + fény b-galaktozidáz Laktóz analóg  kék színű termék KÉK SEJTEK CAT (kloramfenikol acetil transzferáz)

Riporter gének felhasználása pl. Transzkripciós faktorok (TF) tesztelése riporter 1 2 A vektor B vektor 3 1: enhancer 2: promoter 3: TF génje EuK sejt sejtmag TF

Transzgenikus állatok 1982: az óriás egér megtermékenyített petesejt vákum csipesz Növekedési hormon gén injektálása a hím pronukleuszba

A transzgenikus állatok elkészítése 1. Mikroinjektálás (több száz petesejt, mikromanipulátor) 2. Beültetés ál-terhes nősténybe 3. Az utódok ellenőrzése (PCR a farokból) 4. Pároztatás 5. Beltenyésztés - Klónozás?

A transzgenikus állatok klónozása A t-PA-t tejelő egér t-PA + lactalbumin szignál szekvencia szövet specifikus promoter szekréció a tejbe: 0.1 mg t-PA/ml tej Jövő: transzgenikus tehén? (JUH, KECSKE) A transzgenikus állatok klónozása Molecular Farming