Zsiros Viktória Egészségügyi ügyvitelszervező szak 2016 Szövettani technika, biológiai minták előkészítése Fény- és elektronmikroszkópia Sejtalkotók Tájékozódás elektronmikroszkópos képeken Zsiros Viktória Egészségügyi ügyvitelszervező szak 2016

http://hu.wikipedia.org/wiki/Sejt

Mikroszkóp részei: okulár objektívek tárgyasztal makro- és mikrométercsavar kondenzor (blende/rekesz) fényforrás

Minta előkészítés Fixálás Kimosás Víztelenítés Beágyazás Metszetkészítés Festés Lefedés

Minta előkészítés Fixálás más néven: rögzítés célja: megőrizni a szövetet alkotó molekulákat általában 4% paraformaldehid (etil-alkohol (metanol) stb.) elektronmikroszkópiához (EM): glutáraldehid (GA), ozmium-tetroxid (OsO4) néha fagyasztott preparátumokat használnak Kimosás Víztelenítés Beágyazás Metszetkészítés Festés Lefedés

Minta előkészítés Fixálás Kimosás célja: a rögzítőszer eltávolítása, kimosása vízzel (egyéb oldószerrel) EM-hoz: pl. kakodilát, millonig puffer fagyasztott minta esetében ezt a lépést kihagyják Víztelenítés Beágyazás Metszetkészítés Festés Lefedés

Minta előkészítés Fixálás Kimosás Víztelenítés célja: a szövet víztartalmának eltávolítása vízelvonó szerekkel oka: a beágyazószerek általában nem vízoldékonyak (=hidrofóbok) felszálló alkoholsor Beágyazás Metszetkészítés Festés Lefedés

Minta előkészítés Fixálás célja: vékony metszetek készítése intermedier: általában xilol EM-hoz intermedier: propilén-oxid a szöveteket általában paraffinba ágyazzák be, több lépésen keresztül: (intermedier-beágyazószer 2:1, 1:1, 1:2 arányú keveréke) EM-hoz beágyazószer: araldit fagyasztott minta esetében a beágyazószer maga a víz Kimosás Víztelenítés Beágyazás Metszetkészítés Festés Lefedés

Minta előkészítés Fixálás Kimosás Víztelenítés Beágyazás vékony szeletek készítése mikrotóm: normál szövettani metszetek 5-10 μm vastagok (1 sejt kb. 2-40 μm átmérőjű) ultramikrotóm: félvékony (0,5-1 μm) és ultravékony (30-100nm) metszetek (EM) kriotóm (fagyasztott), kriomikrotóm (a fagyasztott mintát is tudják metszeni) metszés után a metszeteket üveglemezre (tárgylemez) teszik Kimosás Víztelenítés Beágyazás Metszetkészítés Festés Lefedés

Minta előkészítés Fixálás Kimosás Víztelenítés Beágyazás célja: megszínezni a különböző szöveti alkotókat a szövetek általában színtelenek! sokféle festék, festési technika használatos pl.: hematoxylin-eosin (HE, a leggyakoribb) azan, Mallory, trichrom (kollagénrost kék) orcein (elasztikus rostok barnák) toluidinkék (félvékony metszetek esetén) immuncitokémia (egyes molekulák kimutatására) Kimosás Víztelenítés Beágyazás Metszetkészítés Festés Lefedés

Minta előkészítés Fixálás Kimosás Víztelenítés Beágyazás Metszetkészítés a megfestett metszetre egy vékony üveglemezt (fedőlemez) ragasztunk a fedőlemeznek mindig felfelé kell lennie, ha a mikroszkópba betesszük a metszetet! Festés Lefedés

HEMATOXILIN-EOZIN FESTÉS sejtmagok kékes színűek (bazofília); a citoplazma, a kötőszöveti rostok pirosasak, rózsaszínesek (acidofília-eozinofília) (emlős tüdő, bronchiolus)

Az elektronmikroszkóp Fény helyett elektronsugarat, lencséül mágneses vagy elektrosztatikus mezőt használó mikroszkóp. Az elektronsugárzás hullámhossza a látható fénynél jóval rövidebb, azaz jóval nagyobb felbontásra képes. Az Abbe képletbe (d=0,61λ/nsinα) helyettesítve az e- sugárzás hullámhosszát érzékelhető, hogy miért nagyobb az elektronmikroszkóp felbontóképessége. Két fő típusa: átvilágító vagy transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM) pásztázó vagy scanning elektronmikroszkóp (SEM)

A transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM) Az elektronnyaláb közvetlenül áthalad a vizsgált tárgyon, és képet alkot egy fluoreszkáló ernyőn. A felbontás nagyon jó: kb. 0,2-0,5 nm. (Fénymikroszkóp feloldóképessége: kb. 0,2 μm (200 nm)) Vákuum, elektromágneses lencsék, nagyfeszültség (80-100 kV), képrögzítés: fluoreszkáló ernyőn v. filmen Nagyítás: néhány ezerszerestől 100.000x-ig Preparátum: igen vékony (kisebb, mint 100 nm) Élő sejtek vákuum miatt nem vizsgálhatók! Kontraszt: nagy atomszámú elemekkel (Os, Ag, Au, Pb, stb.)

Elektronmikroszkóppal a vírusok is megfigyelhetőek

műgyantába ágyazott vizsgálati anyag Ultramikrotom Ultravékony metszetek vastagsága: 50-70 nm Ez a fény hullámhosszának 1/10-e! Egyetlen sejtből kb. 200 ultravékony metszet készíthető! műgyantába ágyazott vizsgálati anyag üvegkés a metszetet finom rézrácsra vesszük fel a metszet széle

A „hagyományos” elektronmikroszkópos technika: Mintavétel Fixálás (aldehidekkel, alkohollal, pikrinsavval, stb.) Kontrasztozás ozmuim-tetroxiddal és uranil-acetáttal Víztelenítés felszálló alkoholsorral, majd propilén-oxiddal Beágyazás: műgyanta (araldit) Metszés ultramikrotómmal (a metszet vastagságát megbecsülhetjük interferencia-színe alapján) Utómunkálatok: Kontrasztozás nehézfémekkel (uranil-acetát, ólom(II)-nitrát) Szenezés (vékony szénréteget párologtatunk a metszet felszínére) Egyéb munkálatok: posztembedding, preembedding, árnyékolás, felszínjelölés Fagyasztott ultravékony metszet készítése: Fixálás Zselatinba történő beágyazás Cryoprotekció: 2,3M-os cukor Fagyasztás folyékony nitrogénnel Metszés cryo-ultramikrotómban (a metszet vastagságát megbecsülhetjük interferencia- színe alapján) Immun-jelölés (a jelölt fehérjét aranyszemcse mutatja) Kontrasztozás (uranil-oxalát, uranil-acetát)

Félvékony metszetek 0,5 μm vastag metszetek (EM célra fixált és beágyazott anyagból) festés: toluidinkék és azúrkék oldatával nagy előnye: igen finom sejtrészletek kivehetőek Májsejtek (nagy nagyítással)

Ultravékony metszetről készült jellegzetes transzmissziós EM felvétel Májsejt részlete

3 napos (D3) gyulladt, patkány hashártya EM képe 3 napos (D3) gyulladt, patkány hashártya EM képe. Citoplazmájában számos sejtalkotó (pl. M, AV, AL) figyelhető meg. (saját felvétel)

Elektronmikroszkópos immuncitokémia fagyasztott ultravékony metszeten A kimutatni kívánt katepszin D lokalizációját a lysosomákban sötét aranykolloid szemcsék jelzik. A májsejtrészlet ultravékony metszetén a kötődött anti-katepszin ellenanyagot egy aranyszemcsékhez adszorbeált második ellenanyag mutatja ki. lysosoma W. Liou felvétele

A pásztázó (scanning) elektronmikroszkóp   Olyan egyszerű elektronmikroszkóp, mely az elektronsugarat egy pontban gyűjti össze a preparátum felszínén. Az elektronsugár a felszíni molekulákból szekunder elektronokat üt ki, melyeket egy detektor regisztrál. A pontszerű elektronsugár soronként letapogatja a felszínt, a detektorban keletkező jel pedig egy katódsugárcsövet vezérel, miáltal azon a TV elvhez hasonlóan a preparátum felszíne leképeződik, erősen nagyított formában. Értelemszerűen a pásztázó elektronmikroszkóp a sejtek és egyéb mikroszkópos struktúrák felszínének vizsgálatára alkalmas.

Vörös- és fehérvérsejtek ér belsejében. Pásztázó (scanning) elektronmikroszkópos felvétel

Vörösvértestek, pásztázó elektronmikroszkópos felvétel Figure 10-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Drosophila feje SEM képen drozi http://www.fhcrc.org/science/shared_resources/em/image_gallery/071906_3_01-3fly.jpg

A durva felszínű endoplazmás retikulum (dER) (A, courtesy of Lelio Orci; B, courtesy of George Palade.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=endoplasmic%20reticulum&rid=mboc4.figgrp.2205

dER és szabad riboszómák Figure 6-62 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

http://images. google. hu/imgres. imgurl=http://www. zoology. ubc http://images.google.hu/imgres?imgurl=http://www.zoology.ubc.ca/~berger/B200sample/unit_8_protein_processing/images_unit8/golgi6.jpg&imgrefurl=http://www.zoology.ubc.ca/~berger/B200sample/unit_8_protein_processing/golgi/lect28.htm&h=331&w=512&sz=64&hl=hu&start=75&um=1&tbnid=0LVGLp2m1qXemM:&tbnh=85&tbnw=131&prev=/images%3Fq%3Dgolgi%26start%3D60%26ndsp%3D20%26svnum%3D10%26um%3D1%26hl%3Dhu%26sa%3DN

A sima felszínű endoplazmás retikulum (sER) Feladatai: Szteroid-szintézis (pl.: Leydig sejtek, mellékvese kéreg) Gyógyszer-detoxikáció (májsejt) Kálcium tárolás (sarcoplazmás retikulum – harántcsíkolt izom) Membránlipidek szintézise Glikogénszintézis (A, courtesy of Daniel S. Friend; B, after R.V. Krstic´, Ultrastructure of the Mammalian Cell. New York: Springer-Verlag, 1979.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=endoplasmic%20reticulum&rid=mboc4.figgrp.2208

Nyugvó és aktivált lymphocyták elektronmikroszkópos képe (A, courtesy of Dorothy Zucker-Franklin; B, courtesy of Carlo Grossi; A and B, from D. Zucker-Franklin et al., Atlas of Blood Cells: Function and Pathology, 2nd edn. Milan, Italy: Edi. Ermes, 1988; C, courtesy of Stefanello de Petris.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=endoplasmic%20reticulum&rid=mboc4.figgrp.4430

Golgi készülék képe (A, redrawn from A. Rambourg and Y. Clermont, Eur. J. Cell Biol. 51:189–200, 1990; B, courtesy of Brij J. Gupta; C, courtesy of George Palade.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=golgi&rid=mboc4.figgrp.2347

A Golgi apparátus funkcionális felosztása Robers S Decker 1974. J.Cell Biol 61,603 Velasko et al. '93, J. Cell Biol 122, 41 A Golgi apparátus funkcionális felosztása A Golgi apparátus ciszternáiban különböző enzimeket találhatunk, amelyeket specifikus ellenanyaggal lokalizálhatunk. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=compartments&rid=mboc4.figgrp.2358

Golgi hálózat megjelenése egér mellékhere sejtjeiben. C=ciszterna,V=vakuólum, MVB=multivezikuláris test, VES=vezikulák Reprinted from the American Journal of Anatomy (Amer. J. Anat. 117, 145) by permission from John Wiley and Sons. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=golgi&rid=eurekah.figgrp.73056

Mikrotubulusok 25 nm átmérővel rendelkező csövek, amelyek fala egy tubulin nevű fehérjéből áll. A tubulinnak két, egymástól kissé eltérő változata van: α és β tubulin, melyek egymáshoz kapcsolódva dimereket alkotnak, így alkotva a mikrotubulus építőköveit. A dimerek egymáshoz illeszkedve hosszú protofilamentumokat alkotnak, amelyekből 13 alkotja a mikrotubulus palástját. A mikrotubulusok vége a sejtközpont (centriolum) közvetlen környezetében horgonyozódik le. (MTOC: mikrotubulus organizáló centrum). A mikrotubulusok polarizáltak (perifériás vég: +, centrális vég: a -) A mikrotubulusok részt vesznek a sejtváz alkotásában, a sejt alakjának fenntartásában, a vezikuláris transzportfolyamatokban (kynezin és dynein fehérjék segítségével), illetve szerves alkotórészei a csillóknak és a centriolumnak is.

A sejtközpont (cytocentrum, centrosoma) A cytocentrum legtöbbször a sejt közepén, a mag behúzódásában helyezkedik el. A centriolum 500nm hosszú, 150nm átmérőjű hengeres struktúra. Két centriolum (egy érettebb és egy újonnan replikálódott) alkotja a centrosomát, amely a mikrotubulusok organizációs helye (MTOC). Feledata: MTOC Sejtosztódás írányítása Csilló bazális testjei http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=centriole&rid=mboc4.figgrp.3343 (A, from M. McGill, D.P. Highfield, T.M. Monahan, and B.R. Brinkley, J. Ultrastruct. Res. 57:43–53, 1976. © Academic Press; C, from M. Paintrand et al., J. Struct. Biol. 108:107–128, 1992. © Academic Press.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=centriole&rid=mboc4.figgrp.3341

A bazális test 9 mikrotubulus triplet alkotja a bazális testet, amelynek megjelenése nagyon hasonló a centriólumhoz. A centriólummal való rokonságot bizonyítja, hogy egymást funkcionálisan helyettesíthetik. http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html (A, courtesy of D.T. Woodrow and R.W. Linck.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=centriole&rid=mboc4.figgrp.3080

Mikrofilamentumok A mikrofilamentumok építőköve az aktin molekula (G-aktin), amelyek egymáshoz illeszkedve egy fonalszerű képletet (F aktin) hoznak létre. Két ilyen aktin-lánc összetekeredve alkotja a mikrofilamentumot. A legtöbb sejtben a plazmamembrán alatt képeznek szövedéket, a membránhoz kihorgonyozva. Gyakran alkotnak kötegeket, mint például a fibrocyták stressz-kötegei, vagy a sejtkapcsoló struktúrák közül a zonula addherensben. A mikrobolyhok sztereociliumainak tengelyében is mikrofilamentumot találunk. Feladatai: Citoplazma-viszkozitás meghatározása (sol-gel állapot) (amőboid mozgás!) Merevítő-támasztó funkció (mikroboholy, sztereocilium) Aktív mozgás (izomsejtek) Membránszkeleton

A mikroboholy http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html

A mitokondrium A mitokondrium a sejtben található, az energia előállításában és annak elraktározásában szerepet játszó sejtszervecske. Az előállított energiát makromolekulák (ATP) formájában tárolja. A mitokondrium baktérium alakú (henger vagy gömb) és méretű (néhány mikrométer), kettős membránrendszerű sejtszervecske. Az eukarióta sejtekben legalább egy, de akár több ezer példányban fordul elő. Az intenzív anyagcserét folytató sejtekben találhatunk belőle többet, ami összefügg a sejtszervecske feladatával: a sejt energiatermelő központja. Felépítésére jellemző, hogy külső membránja sima, feszes felületű, míg belső hártyarendszere erőteljesen megnövelve felületét, redőzött (krisztás vagy csöves mitokondrium).

Röchlic Pál: Szövettan tankönyv 1999. Illetve http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html

Basalis csíkolat vese tubulus hámsejtben Spermium – nyak http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html

Mitokondriumok osztódása és fúziója EM képen (B, courtesy of Daniel S. Friend.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=mitochondrion,dividing&rid=mboc4.figgrp.2606

A peroxiszóma Feladat: Glikogén anyagcsere (glikogenezis) -0,1-1 mm nagyságú, membránnal határolt organellum -EM-pal belsejében közepes sűrűségű, finoman granuláris anyag fedezhető fel, esetenként urát-oxidáz enzim által alkotott kristályok -oxidatív enzimei közé tartozik pl. a peroxidáz és a kataláz Feladat: Glikogén anyagcsere (glikogenezis) Purin-lebontás Lipid anyagcsere (zsírsav oxidáció) Detoxikáció (méregtelenítés) pl. etanol oxidációja acetaldehiddé Előfordulás: Májsejtek, vesehámsejtek Peroxiszómák májsejtben (patkány) (Courtesy of Daniel S. Friend.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=peroxisomes&rid=mboc4.figgrp.2195

Peroxiszóma növényi sejtekben (A, from S.E. Frederick and E.H. Newcomb, J. Cell Biol. 43:343–353, 1969. © The Rockefeller Press; B, from W.P. Wergin, P.J. Gruber, and E.H. Newcomb, J. Ultrastruct. Res. 30:533–557, 1970. © Academic Press.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=stored&rid=mboc4.figgrp.2198

nucleus Késői endoszómák (multivezikuláris testek MVB) és lizoszómák (Ly) HepG2 sejtben Bar: 200nm MVB Ly Ly MVB MVB MVB MVB MVB nucleus

Autofagoszómák

Tárolt tápanyagok, pigmentek a sejtekben Glikogénszemcsék Tárolt tápanyagok, pigmentek a sejtekben Zsírcseppek Kupffer sejtekben Zsírcseppek szteroidhormont szintetizáló mellékvese kéreg sejtjeiben Zsírcsepp adipocytában Pigmentszemcsék bőr melanocytában http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html

Májsejt elektronmikroszkópos képe. (Courtesy of Daniel S. Friend.) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=compartments&rid=mboc4.figgrp.2137

Felhasznált források: Röhlich: Szövettan, 3. kiadás, Semmelweis Kiadó Budapest Alberts – Johnson – Lewis – Raff – Roberts – Walter: Molecular biology of the cell. 5. kiadás, Garland Science Lodish et al. Molecular cell biology, 5. kiadás, W. H. Freeman publishers Dr. Kocsis Katalin szövettani bevezető előadása Dr. H-Minkó Krisztina elektronmikroszkópos előadása http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/SzovettaniEsSejttaniVizsgaloModszerek/index.html Moll%20 Biol%20Cell/W_%20H_%20Freeman%20 Publishers%20-%20 Molecular%20 Cell%20Biology.htm