Molekuláris biológiai módszerek

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária
Advertisements

KŐVIRÁG 6.
“Valós idejű” polimeráz láncreakció (RT-PCR)
A klinikai adatok és a biológiai minták minőségbiztosításának jelentősége a biobankok életében Magyarósi Szilvia és a SCHIZO-08 Konzorcium tagjai Molekuláris.
Mutációk.
Delta Bio 2000 Kft. Ügyvezető: Dr. Haracska Lajos
A hepatitis B elterjedése világszerte
A polimeráz láncreakció Gurbi Bianka március 4. Emelt Biotechnológiai Számítások.
DNS replikáció Szükséges funkciók Iniciáció
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor.
Fehérjeszintézis Szakaszai Transzkripció (átírás)
Oligonukleotid szintézis
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
A universal method for automated gene mapping Peder Zipperlen, Knud Nairz, Ivo Rimann, Konrad Basler, Ernst Hafen, Michael Hengartner and Alex Hajnal Genome.
Strukturális genomika Gyakorlati feladatok. SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?
Molekuláris genetika Falus András.
Antigén receptorok Antitest, T sejt receptor A repertoire (sokféleség) kialakulása Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Falus András.
Kedvenc Természettudósom:
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító.
génszabályozás eukariótákban
Polimeráz láncreakció (PCR)
MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI
Buccalis kenet a connexin-26 gén 35delG mutációjának non-invazív szűrésére kisgyermekeken Torkos Attila 1,2, Magnus Teschner 2, Peter Erfurt 2, Gerrit.
Öröklődés molekuláris alapjai
Ahhoz, hogy dolgozni tudjunk égy adott génnel, vagy szekvenciával nagy mennyiségű DNS-re van szükségünk, ezért valamilyen módon „klónozni” kell, a gén.
Géntechnikák Laboratórium
Polimeráz láncreakció
2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények.
DNS amplifikáció pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van
DNS chipek, DNS hibridizáció
Az izomdystrophiák molekuláris genetikai vizsgálata
Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése
A gélelektroforézis Alkalmazása: különböző molekulák (nukleinsavak, fehérjék) -méret szerinti elválasztását, -detektálását -mennyiségének meghatározását.
AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE. AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT Könnyű lánc (L) Nehéz.
Génsebészet Cseh Zsófia.
ELVÁLASZTÁSTECHNIKA 1.
ELŐNYÖK ÉS LIMITÁCIÓK MOLEKULÁRIS MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ALKALMAZHATÓSÁGA A BIOREMEDIÁCIÓBAN Balázs Margit.
Nitrifikáció vizsgálata talajban
Lipáz enzimaktivtás mérése
1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA
IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László.
A P elemek mobilitásának szabályozása
A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása
Készítette: Czigléczki Gábor
Gyakorlati képzés: Genetikai variációk igazolása PCR segítségével.
Receptor és szenzor fehérjék számítógépes tervezése Összeállította: Kiss Lóránd 2009.április.24. Bioinformatika szakirodalmi tanulmányok.
Gének, környezet, viselkedés
Molekuláris klónozás a gyakorlatban. CRISPR/Cas rendszerek Adaptív bakteriális immunitás Idegen nukleinsavak ellen ( pl. vírusok) Ezek integrálása a genomba,
Immunoprecipitation Gyakorlati munka I. rész. Kísérleti protokoll Protokoll.
DNS szintézis, replikáció Információ hordozó szerep bizonyítéka Avery-Grifith kísérlet Bakterifágos kísérlet.
Az első észleléstől az intenzív osztályig Diagnosztikus lehetőségek
Primer tervezés qPCR-hez
Új molekuláris biológiai módszerek
Polimeráz Láncreakció:PCR, DNS ujjlenyomat
Polyacrylamid-Gél Elektroforézis (PAGE)
Replikáció Wunderlich Lívius 2015.
Új molekuláris biológiai módszerek labor
Molekuláris biológiai módszerek
Új molekuláris biológiai módszerek
Proteomika, avagy a fehérjék „játéka”
Új molekuláris biológiai módszerek
Molekuláris biológiai módszerek
Győri Edit Lelle Kocsis Kinga
A DNS replikációja Makó Katalin.
Új molekuláris biológiai módszerek
ASPERGILLUS FLAVUS ÉS FUSARIUM SPP. ELŐFORDULÁSA HAZAI KERESKEDELMI FORGALOMBAN KAPHATÓ FŰSZERPAPRIKA MINTÁKBAN Készítette: Lehotkai Péter
Biotechnológia, génmanipulációk, transzgenikus élőlények
Az első észleléstől az intenzív osztályig Diagnosztikus lehetőségek
FOLYTONOS FERMENTÁCIÓ
Előadás másolata:

Molekuláris biológiai módszerek Polimeráz láncreakció http://www.ppdictionary.com/tutorials/Polymerase_Chain_Reaction.htm

PCR:Polimerase Chain Reaction 1983 Kary Mullis 1993 Nobel díj X darab ds DNS n darab ciklus X·2 ·n darab produkt X ·2n-2 darab produkt DNS templát, dNTP mix, primerek, Mg2+, puffer, hőstabil DNS-polimeráz Taq: Thermus aquaticus

Tipikus reakciókörölmények 0,2-0,5 ml, vékony fal, vagy plate; kapilláris Ásványolaj, vagy fűtött tető Touchdown, vagy gradiens annealing 94-95 ºC 3-10’ 94 ºC 15-60 sec 45-60 ºC 30-60 sec 72 ºC 30’’-3’ 72 ºC 2-5’ 4 ºC Hold 20-30x melting annealing extension

Kontamináció elkerülése!! PCR felhasználása: Genetikai manipuláció (klónozás, site-directed mutagenezis, stb) Szekvencia analízis (szekvenálás, fertőzések) Mutációk, polimorfizmusok (beteségek, öröklődés, apaság) Mennyiségi vizsgálatok (mRNS szintek) Specificitás!! Kontamináció elkerülése!!

Tris puffer, pH: 8,3-8,8 (~7,2 72 °C-on), 50 mM KCl Mg2+: kb. 1,5 mM, optimalizálni (0,5-5 mM) Templát DNS: ss vagy ds, cirkuláris hatékonysága kisebb Primerek: Körültekintően tervezni, GC, multiplex PCR 0,1-0,5μM/primer (6x1012-3X1013 db) 30 ciklushoz Koncentráció növelése: mispriming dNTP-k: 200-250 μM, pH: 8,1, PP-mentes, alikvotok Taq polimerase: 0,5-2,5 U/ 25-50μl (= 2-10 x 1012 db enzim/cső) a limitáció kezdete: 1,4-7 x 1012

Munkakörülmények + és – kontrollok! Külön labor, elszívó fülke, külön asztal Kesztyű, maszk, fejfedő, lélegzet, mászkálás Tiszta eszközök, csövek, hegyek Amplikon külön kezelése, centrifuga Alikvotozott reagensek, csak PCR-hez Dekontamináció: 10% Chlorox, UV Kontamináció esetén: Mindent csere Összemérés: Jégen Hot Start: Viasz, vagy antitest + és – kontrollok!

Primer tervezés 18-25 nukleotid, hossz különbség <4 G vagy C: 60-40%, változatos nukleotidok Saját, ill. másik primerrel <4 komplementer Komplementaritás hiánya, hairpin, primer dimer Repetitív szekvenciák kerülése Tmelt különbség ≥5 ºC 3’ vég fontossága; G v. C, de nem GC vagy CG 5’ vég: változatos lehet, promóter, restr. endo., stb. cDNS: különböző exonokra Degenerált oligonukleotidok aminosavakra Oligo tervező programok, blast, multiplex PCR

Főbb hőstabil polimerázok 45000 380000 Rekombináns, koktélok, fúziós, hot-start: Nagy precizitás, nagy sebesség, termostabilitás

Adalékanyagok Növelik a specificitást és az DMSO Betaine DTT BSA Glicerin Növelik a specificitást és az amplikon lehetséges hosszát: Optimalizálni kell ! Multiplex PCR optimalizálás PCR master mixek speciális puffer-rendszerekkel

Touchdown, vagy gradiens annealing Termoblokkos PCR-készülék Forgótárcsás PCR-készülék Specifitás növelése: Touchdown, vagy gradiens annealing

PCR felhasználása: Genetikai manipuláció (klónozás, site-directed mutagenezis, stb) Szekvencia analízis (szekvenálás, fertőzések) Mutációk, polimorfizmusok (beteségek, öröklődés, apaság) Mennyiségi vizsgálatok (mRNS szintek)

Extra szakaszok

SNP vagy pontmutáció kimutatása

Pontmutáció kimutatása PCR-rel G C T A primer 1 primer 2 nincs mutáció van mutáció direkt elrontott nukleotid 1. 2. van PCR-termék nincs Pontmutáció kimutatása PCR-rel

Mennyiségi kimutatás PCR kezdetben exponenciális Limitáló tényezők: dNTP, primerek, enzim Detektálás gélelfóval: Jóval az exponenciális Rész felett, a telítés közelében Megoldások: Higítási sorok, ciklusszám változtatás, radioaktív PCR és real-time PCR