14. TÖMEGSPEKTROMETRIA 14.1. A tömegspektrométerek fő részei. Az egyszeres fókuszálású tömegspektrométer működése 14.2. Ionizációs módszerek 14.3. Tömeg-analizátorok 14.4. A tömegspektrometria alkalmazásai
14.1. A tömegspektrometria alapjai Izolált, ionizált részecskék tömeg-töltés arányuk szerinti elválasztása Angolul: Mass Spectrometry (MS)
Tiofén tömegspektruma 84 58 45 39 NIST Chemistry WebBook (htpp://webbook.nist.gov/chemistry)
Tiofén ion fragmentációja + + + +
A tömegspektrométer fő részei mintabevitel ion gyorsító tömeg- analizátor ionizátor detektor vákuum jelfeldolgozás
Egyszeres fókuszálású tömegspektrométer
Egyszeres fókuszálású készülék: Az anyagot ionizálják, az ionokat először elektromos térben gyorsítják, majd mágneses térben elválasztják.
A kinetikus energia: Elektromos tér (iongyorsító) A részecske tömege m, elektromos töltése e. U feszültséggel gyorsítjuk. A kinetikus energia:
Homogén mágneses tér (tömeganalizátor) (A mágneses indukció iránya merőleges a belépő töltés mozgásának irányára) Lorentz erő: e: az ion töltése (az elemi töltés egyszerese, kétszerese, stb.) v: az ion sebessége B: a mágneses indukció
B: merőleges a papír síkjára A mozgás irányára merőleges erő körmozgásra készteti az ionokat (centripetális erő). Jobb-kéz szabály: hüvelykujj az áram irányába a többi kinyújtott ujj a mágneses tér irányába. Tenyerünk így az erő irányába mutat. B: merőleges a papír síkjára
Körmozgás feltétele: centripetális erő = Lorentz erő
Töltött részecskék szétválása mágneses térben
14.2. Az ionizáció módszerei Gőzfázisú módszerek elektron ütközéses ionozáció kémiai ionizáció Deszorpciós módszerek szekunder ion tömegspektrometria bombázás gyors atomokkal MALDI Elektroporlasztásos ionizáció
Az ionizáció módszerei a) Elektronütközéses ionizáció (pozitív gyökion) (negatív gyökion) A pozitív gyökionok stabilabbak. A tömegspektrometria csaknem kizárólag pozitív ionok szétválasztásával foglalkozik.
Elektronütközéses ionizáció (electron impact, EI) Izzószál (termikus elektronemisszió) e- minta (gőz) M+ ion gyorsító rések 1.rés: taszító (+) 2. rés: vonzó (-) 3. rés vonzó (-----) anód ütköző e- en. 70keV
Az ionok tovább bomlanak párhuzamos és konszekutív reakciókban Fragmentáció Az ionok tovább bomlanak párhuzamos és konszekutív reakciókban EI ionizátor: E(e-) ~ 70 eV E(ionizáció): 10-20 eV Sok magasan gerjesztett állapotú ion keletkezik fragmentációval stabilizálódnak
b) Kémiai ionizáció (CI): ez is EI, de a mintához nagy feleslegben (~ 0,5 Torr) reagens gázt (CH4, NH3, izobután) adnak Elsősorban a reagens gázok ionizálódnak, ezek ütköznek a vizsgálandó molekulákkal. Főleg MH+ ionok (molekulacsúcs) keletkeznek: a molekulacsúcs azonosítására szolgál.
Citronellol kémiai ionizációs tömegspektruma Reagensgáz: i-C4H10 EI, fragmentáció: i-C4H10 → i-C4H9+ CI: M + i-C4H9+ → MH+ + i-C4H8 (proton átadás) http://www.chem.unl.edu/dsmith/Chemical Ionization.pdf
Citronellol EI-vel és CI-vel kapott tömegspektruma
c) Szekunder ion tömegspektrometria (SIMS, Secondary Ion Mass Spectrometry) http://www.geos.ed.ac.uk/facilities/ionprobe/SIMS4.pdf Szilárd mintát Ar+ ionokkal vagy O2+ ionokkal bombáznak. A felületről atomok és ionok lépnek ki. A felület vizsgálatára szolgáló módszer. Pásztázva az ionsugarat: összetétel pontonkén, Maratás: összetétel a mélység függvényében.
d) Bombázás gyors atomokkal (FAB, Fast Atomic Bombardment) Nem illékony mintákra alkalmas. A mintát feloldják (pl. glicerinben). Semleges atomokkal (Ar, Xe) bombázzák Biológiai, gyógyszeripari minták vizsgálata
The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules" John B. Fenn 1917- 2010 Koichi Tanaka 1959-
(biológiai makromolekulák ionjai gőzfázisban) A repülő elefánt (biológiai makromolekulák ionjai gőzfázisban)
e) MALDI = matrix-assisted laser desorption-ionisation (Tanaka) mátrix: aromás sav
f) Elektroporlasztásos ionizáció ESI = Electrospray Ionisation (Fenn) 3000 V
Detektor: elektronsokszorozó Katód az ionok detektálására érzékeny Nincs ablaka (nagy vákuumban van) http://huygensgcms.gsfc.nasa.gov
Felbontás: M a vizsgálat ion móltömege, M az éppen még felbontott két csúcs közötti tömegszámkülönbség Pl. 500-as felbontás esetén az 1000-es és az 1002-es tömegszámú csúcsot külön jelzi, az 1000-es és az 1001-es tömegszámú csúcs egybeolvad.
14.3. Tömeganalizátorok Csoportosítás a tömeganalizátor szerint: Egyszeres fókuszálású tömegspektrométer Kettős fókuszálású tömegspektrométer Kvadrupol tömegspektrométer Repülési idő tömegspektrométer
a) Egyszeres fókuszálású tömegspektrométer
Spektrum: mágneses tér változtatásával vagy gyorsító feszültség változtatásával Felbontás: 100-tól néhány 1000-ig
b) Kettős fókuszálású tömegspektrométer Az ionok elválasztása két lépésben, elektromos térrel és mágneses térrel Felbontás: néhány tíz ezertől 100 ezerig
Kettős fókuszálású tömegspektrométer
c) Kvadrupol tömegspektrométer Négy elektród (párhuzamos fémrudak) Közöttük halad az ionsugár. Két-két szemben lévő elektród mindig azonos potenciálon van. A potenciálnak váltóáramú és egyenáramú komponense is van.
Kvadrupol tömegspektrométer
Az elektródok feszültsége az idő függvényében
Adott feszültség-amplitúdók esetén egy bizonyos tömegtartományba eső ionok oszcillálnak. Még mielőtt belezuhannának az egyik elektródba, megfordul a polaritás. Így az ionok végigjutnak a rudak közötti üregen és elérik a kilépő rést. Az eltérő m/e-vel rendelkező ionok egyre nagyobb amplitúdóval oszcillálnak, és belezuhannak valamelyik elektródba.
Előnyök: gyors (nem a mágneses teret változtatjuk) m/e lineárisan változik a térerősséggel Felbontás: max 3000
d) Repülési idő tömegspektrométer (TOF: Time Of Flight) Az iongyorsítóban a különböző tömegű (de azonos töltésű) ionok azonos energiára tesznek szert: A nagyobb tömegűek kisebb sebességűek, a kisebb tömegűek nagyobb sebességűek lesznek.
Repülési idő tömegspektrométer Felbontás: néhány száztól néhány százezerig
14.4. A tömegspektrometria alkalmazásai a) Analitikai alkalmazások Szerves molekulák szerkezetvizsgálata Polimerek vizsgálata Proteomika: fehérjék vizsgálata
a) Analitikai alkalmazás Gázkeverékek kvantitatív analízise Kromatográfiával kombinált tömegspektrometria (GC-MS, LC-MS) Nyomelemzés Izotóp-arány mérés Elemanalízis
Példa: klozapin elemanalízise Módszer: (ESI)MS-TOF Elemanalízis nagypontosságú tömegspektrometriával (HRMS) Példa: klozapin elemanalízise Módszer: (ESI)MS-TOF http://www.chem.agilent.com/Library/posters/Public/ASMS_2011_TP_242.pdf
Számított pontos molekulatömegek 1H 1,0078 2H 2,0141 12C 12,0000 13C Elemanalízis nagypontosságú tömegspektrometriával (HRMS) Pontos izotóptömegek Számított pontos molekulatömegek 1H 1,0078 2H 2,0141 12C 12,0000 13C 13,0034 14N 14,0031 16O 15,9949 35Cl 34,9689 37Cl 36,9659 12C181H1935Cl14N4 326,1295 (kém. Ionizáció miatt) 12C181H2035Cl14N4 327,1373 12C1713C1H2035Cl14N4 328,1407 12C181H2037Cl14N4 329,1343
b) Szerves molekulák szerkezetvizsgálata A csúcsok típusai: Molekulacsúcs Fragmens csúcsok M+A++B Többszörös töltésű csúcsok Metastabil csúcsok (rövid élettartamú ionok)
n-bután
n-bután 1) molekulacsúcs m/e = 58-nál viszonylag kis intenzitású 2) m/e = 43-nál van a legvalószínűbb csúcs 58-43 = 15, tehát egy metil-csoport hasadt le, C3H7+ ionból származik 3) m/e = 59-nél kis csúcs, 13C illetve 2H természetes jelenléte miatt (szatelit csúcs) 4) m/e = 29 C2H5+ de C4H102+ is. 5) m/e = 25,5 51-es, 2-szeres töltésű ion.
c) polimerek vizsgálata Polisztirol analízise MALDI-TOF tömegspektrométerrel 20000-es molekulatömegű polisztirol Mátrix: 2-nitrofenil-oktiléter U. Bahr, Anal. Chem. 64, 2466 (1992)
d) fehérjék szerkezetvizsgálata 1. lépés: Fehérje bontása enzimmel peptidekre http://www.moffitt.org/
d) fehérjék szerkezetvizsgálata 2. lépés Fehérje bontásából előállított peptid spektruma (MS/MS)
Alapkérdések 91. Milyen mennyiségeket tüntetnek fel a tömegspektrumok tengelyein? 92. Mit nevezünk a tömegspektrumban molekulacsúcsnak, ill. báziscsúcsnak? 93. Mit nevezünk a tömegspektroszkópiában fragmentációnak? Írjon fel rá példát! 94. Mik a tömegspektrométerek főbb egységei? (blokkdiagram) 95. Mit nevezünk a tömegspektrométer felbontásának? 95. Mi a lényege a MALDI ionizációs módszernek? 96. Mi a lényege az elektroporlasztásos ionizációnak? 97. Mi a működési elve a repülési idő tömegspektrométerek analizátorának? 98. Mi az alapelve a tömegspektrometriai módszerrel végzett elemanalízisnek?