KÓRHÁZI JÁRVÁNYBÓL SZÁRMAZÓ ACINETOBACTER BAUMANNII IZOLÁTUMOK JELLEMZÉSE molekuláris epidemiológiai osztály Fágtipizálási és Krucsó Barbara1, Pászti Judit1, Lajos Zoltán2, Kurcz Andrea2 1Országos Epidemiológiai Központ, 2ÁNTSZ Fővárosi Intézet OEK ÖSSZEFOGLALÁS Az Acinetobacter baumannii, mint fakultatív patogén leggyakrabban intenzív terápiás osztályokon hospitalizált betegek kolonizációja kapcsán, nosocomiális infekciók során szerepel. Sokszor jelen van a kórházi környezetben, de a fertőző forrás gyakran ismeretlen marad. A vizsgálatokat nehezíti, hogy a tipizálás hagyományos módszerekkel nem lehetséges megbízhatóan. Egy kórházi intenzív terápiás osztályról származó 2002-2003 során beküldött 13 beteg különböző váladékából és 3 higiénés mintából származó izolátumok epidemiológiai tipizálását végeztük el.A genom-tipizálás PCR-rel (ERIC2, DAF4 primerrel) és PFGE-sel történt, továbbá a törzsek antibiotikum érzékenység és integron tartalmát is meghatároztuk(antibiotikum rezisztencia terjedése miatt fontos). A különböző tipizálási módszerekkel kapott eredményeket összevetve, (ERIC-PCR, DAF-PCR, PFGE) mindhárom módszer alkalmas az epidemiológiai összeffüggések felderítésére. Az eredmények alapján a 2002-es járvány során több különböző törzs volt jelen. A 2003-as törzsek különbözőnek bizonyultak. Integron jelenlétét 4, 2003-ban izolált törzsben tudtunk kimutatni. Az integron 2 gént aaCa1 és aadDa1 (gentamicin ill. streptomycin és spectinomycin rezisztenciát kódoló) hordoz. 4. ábra A. BAUMANNII TÖRZSEK INTEGRON MINTÁZATA 3’CS-5’CS PRIMERREL M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M bp bp 2645 1605 676 517 460 396 350 222 2500 BEVEZETÉS 2. táblázat ANTIBIOTIKUM ÉRZÉKENYSÉG VIZSGÁLATA KORONGDIFFÚZIÓS MÓDSZERREL Az A. baumannii törzsek izolálásának száma 2000-2002 között mérsékeltem emelkedett, jelentősebb növekedést (kórházi laboratóriumokban izolált) invazív törzsek mutatnak. A multirezisztens izolátumok számának emelkedése a nemzetközi adatok szerint emelkedő tendenciát mutat, mely a hazai kórházi anyagban is megfigyelhető. 1. ábra A. BAUMANNII IZOLÁTUMOK ÉS AZ INVAZÍV TÖRZSEK SZÁMA 2000-2002 KÖZÖTT* * az adatok a Johan Béla OEK ÁNTSZ valamint az egyetemek és kórházak 2000-2002 évi járványügyi- klinikai mikrobiológiai munkájának értékelése módszertani kiadványból származnak. ELŐZMÉNYEK Net:Netilmicin, Tob:Tobramycin, Cn:Gentamicin, Ak:Amikacin, Nor:Norfloxacin, Cip:Ciprofloxacin, Mem: Meropenem, Ipm:Imipenem, Fep: Cefepime, Caz: Ceftazidime, Cfp: Ciprofloxacin, Prl: Piperacillin, S:Streptomycin, K: Kanamycin, C: Chloramphenicol, Te: Tetracycline Egy kórházi intenzív osztályon lezajlott járvány során a 16 exponált közül 2 beteg, 2 tünetmentes ürítő került felderítésre. Egy haláleset történt, melynek közvetve a kórházi infekció volt az oka. Járvány kivizsgálása során 66 higiénés minta közül 3 bizonyult pozitívnak. MUNKÁNK CÉLJA 2. ÁBRA A. BAUMANNII TÖRZSEK PCR MINTÁZATA ERIC-2 PRIMERREL 2002 július-augusztus között, lezajlott kórházi járványból, a járványügyi célú mintavételezésből és a járványt követő időszakból (2003) származó 18 multirezisztens A. baumannii törzsek vizsgálata, annak eldöntésére, 2002 évi járvány során izolált törzsek egy genetikai klónnak tekinthetők-e; az epidemiológiai vizsgálat során vett higiénés mintákból izolált törzsek megegyeznek-e a betegekből származó törzsekkel; a járványt követő időszakban izolált törzsek megegyeznek-e a járványtörzzsel ; a különböző tipizálási módszerek összehasonlítása ; A törzsek integron tartalmának vizsgálata, mivel rezisztencia gének horizontális transzfere is hozzájárulhatnak egy járvány kialakulásához Az integron mintázatban látható, a 2500 bp-nál kisebb méretű amplikonok aspecifikus termékek, komplett integront csak a 2003-ban izolált, 12, 16,18,20 izolátum hordozott. 1. táblázat VIZSGÁLT TÖRZSEK AZ IZOLÁLÁS IDEJE ÉS FORRÁSA SZERINT 3. táblázat A. BAUMANNII TÖRZSEKKEL VÉGZETT VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEFOGLALÁSA Az A. baumannii törzsek-egy kivétellel, két csoportba tartoztak a kapott mintázat alapján. Az eltérő mintázatokat típusokba (A,B,C) és altípusokba soroltuk (B/1, B/2). Az A és B csoportok mintázata kis eltérést mutat, ez alapján a klonális kapcsolatot nem lehet kizárni. Izolálás ideje 2002 Sorszám Törzsszám Váladék 1 48 trachea 2 49 hemokultura 3 50 orr 4 51 5 53 liquor 6 55 higiénés vizsgálat 7 56 8 57 9 58 10 60 11 61 12 64 13 65 vizelet 14 68 2003 15 16 17 18 20 3. ÁBRA A. BAUMANNII TÖRZSEK PCR MINTÁZATA DAF4 PRIMERREL Az A. baumannii törzsek-egy kivétellel, két csoportba tartoztak a kapott mintázat alapján.. Az A és B csoportok mintázata jobban elkülönült. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Antibiotikum rezisztencia meghatározás: az antibiotikum érzékenység meghatározás korongdiffúzióval Mueller Hinton agaron történt az NCCLS útmutatója szerint a következő korongokra : Net:Netilmicin (30mg), Tob:Tobramycin (10mg), Cn:Gentamicin(10mg),Ak:Amikacin (30mg), Nor:Norfloxacin (10 mg), Cip:Ciprofloxacin (5mg), Mem: Meropenem (10mg), Ipm:Imipenem (10mg), Fep: Cefepime (30mg), Caz: Ceftazidime (30mg), S:Streptomycin (10mg), K: Kanamycin, C: Chloramphenicol (30mg), Te: Tetracycline (30mg). PCR A genom-tipizálásához a primereket korábban publikált eredmények alapján választottuk ki. Az ERIC 2 primer célpontja enterobacteriális imétlődő szekvenciák (Steinbrueckner et al. 2001 szerint) ,míg a DAF4-é konzervált szekvenciák (… szerint). 1-es tipusú integron kazetta kimutatása 5’CS és 3’CS primerekkel történt (Ploy et al. szerint). Az amplifikált termékeket futtatása1.75%-os agaróz gélben történt. Pulzáltatott mezejű gél elektroforézis (PFGE): Az egy éjszakán át (18h 37 °C) Nutrient agaron növesztett sejtek telepeiből plagot készitettünk…. szerint A restrikciós emésztés Apa1 enzimmel történt a gyártó ajánlása szerint. A futtatás 0.5x-es TBE oldattal készített 1%-os agarban történt, optimalizált paraméterek mellett, 24h, 14 °C-on CHEF DRII készülekben. Lambda markert futtattunk molekulasúly standardként. A gélek kiértékelése : A géleket etídium-bromiddal festettük, majd a GelDoc készülékben detektáltuk a termékeket.. A kiértékelést vizuálisan és számítógépes szoftver segítségével végeztük el. Integron azonosítása szekvencia analízissel A szekvenáláshoz 1 törzs 3 termékét választottuk ki. Az 5’CS3’CS integron PCR-rel kapott termékeket QIAquick Gel(Qiagen Inc., USA) extrakciós kittel tisztítottuk ki. A szekvenálás ABI 373 tipusú DNS szekvenátorral történt. A kapott szekvenciákat a BLAST program segítségével hasonlítottuk össze az NCBI adatbázissal. 4. ábra A. BAUMANNII TÖRZSEK PFGE MINTÁZATA ApaI RESTRIKCIÓS ENZIMMEL TÖRTÉNT EMÉSZTÉSSEL ÖSSZEFOGLALÁS A különböző tipizálási módszerekkel kapott eredményeket összevetve, (ERIC-PCR, DAF-PCR,PFGE) mindhárom módszer alkalmas az epidemiológiai összeffüggések felderítésére. Az eredmények alapján a 2002-es járvány során több különböző törzs volt jelen. A PFGE a törzseket jobban diszkriminálta, több szubtípust tudtunk megkülönböztetni. Ezek szubtípusok valószínűleg egy endemikus törzsből alakulhattak ki mutációk során (A1, A2, A3 típusok, ill. B1, B2 típusok).Egy esetben találtunk eltérést. A 2003-ban izolált törzseket a DAF-PCR nem különböztette meg a 2002-ben izolált B típusú törzsektől, ERIC-PCR-rel a B típus egyik altípusának bizonyult, míg a PFGE-sel különböző típusnak bizonyult, így ezek valószínűleg genetikailag nem rokonok. Egyezést találuk higiénés törzsek és a betegekből izolált törzsek közt is, PCR-rel és PFGE-vel is azonos mintázatot mutattak. Az antibiotikum rezisztencia mintázatok is jól egyeztek a genom-tipizálási módszerrekkel kapott eredményekkel, bár az így kapott eredmények leginkább elővizsgálatra alkalmasak, mivel fenotípusos jelleget vizsgálnak Integron jelenlétét 4, 2003-ban izolált törzsben tudtunk kimutatni, mely 2 antibiotikum rezisztenciát kódoló gént aaCa1 és aadDa1 gentamicin ill. streptomycin és spectinomycin hordoz. . bp 2645 1605 676 517 460 396 350 222 A törzseket mintázatuk alapján 4 fő csoportba tudtuk elkülöniteni. Az A csoporton belül is 3 szubípust tudtunk elkülöníteni (A1, A2, A3), a B típuson belül 2 szubtípust (B1, B2). IRODALOM 1. E. Bergogne-Bérézin, K. J. Towner.1996 Acinetobacter spp. As Nosocomial pathogens Microbiological, Clinical, and Epidemiological features 2. K. J. Towner.1997 Clinical importance and antibiotic resistance of Acinetobacter spp. 3. Fred C. Tenover; Robert D. Arbeit; MD, Richard V. Goering 1997 How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections A review of healthcare epidemiologist.