Primer tervezés qPCR-hez 6. gyakorlat

PCR/qPCR PCR: egy molekuláris biológiai technológia DNS enzimatikus amplifikálására (azaz a kópiák megsokszorozására) élő szervezet, például E. coli vagy élesztő igénybevétele nélkül qPCR: PCR alapú módszer, mely lehetővé teszi a PCR ciklusok során keletkező termék valós idejű detekcióját és mennyiségi mérését a módszer széleskörűen alkalmazható génexpresszió analízisre, genetikailag módosított organizmusok (GMO) kimutatására, SNP genotipizálásra, allél diszkriminációra, vírus terhelés mérésére

PCR lépései A PCR reakció két fő részből áll: az első rész a denaturáció (polimeráz aktiváció), a második a három lépéses ciklus (denaturáció, annealing, extenzió). 1. rész – Denaturáció A reakció kezdetén a denaturáció során a DNS kettős hélix szerkezete felbomlik és szétválik két egyszálú DNS molekulára. A denaturációs hőmérséklet általában 92-95 °C, ideje 1-5 perc. 2. rész – A célszekvencia amplifikálása 3 ciklusból áll, mely ismétlődik a reakció során, általában 30x Denaturáció: az előző ciklusokban újonnan szintetizálódott DNS láncok denaturációja, 95 °C-on. Annealing (primer bekötődés): a denaturációt követően a hőmérsékletet csökkentjük a primer pár Tm-nek megfelelő hőmérsékletre. A primerek bekötődnek a komplementer templát szekvenciához, így a következő lépésben az enzim számára megfelelő kezdőpontot adnak a lánchosszabbítás elindításához. Elongáció (lánchosszabbítás): A DNS polimeráz enzim megkezdi a lánchosszabbítást, a primerektől indulva a 3’ végekhez a templátnak megfelelő komplementer nukleotidokat kapcsolja hozzá a lánchoz. A folyamat mindaddig tart, amíg a hőmérsékletet ismét nem emeljük 95 °C-ra, amellyel újra indul a ciklus.

A DNS mennyiségének detektálása A Real-Time PCR során a DNS mennyiségének mérése fluoreszcens detektáláson alapul, amihez kettős szálú DNS-hez kötődő fluoreszcens festékeket (SYBR Green I, EvaGreen) vagy fluoreszcensen jelölt szekvenciaspecifikus próbákat (pl.:Taqman, Hibridizációs próba, Molecular Beacon…stb.) használnak. A qPCR mérés alapvető feltétele, hogy a fluoreszcens jel erőssége egyenesen arányos legyen az amplikon mennyiségével.  A SYBR® Green I egy kettősszálú DNS-kötő fluoreszcens festék, melynek fluoreszcenciája kb. 2000-szer magasabb kettős szálú DNS-hez kötötten, mint szabadon. Gerjesztési maximuma 494 nm, emisszós maximuma 521 nm. A Real- Time PCR-ben a SYBR Green fluoreszcenciájának detekciója minden ciklusban a lánchosszabbítási lépés végén történik. Univerzális kettős-szálú DNS-kötő tulajdonságából következik, hogy bármilyen szekvenciához használható, ugyanakkor a fluoreszcens jel nem specifikus egy adott amplikonra. Különösen fontos ezért a primerek specifitása, és a primer-dimer képződés elkerülése.

Primer tervezés I. Primer hossz: 18-25 bázispár Primer olvadási hőmérséklete: 57-63 °C. opt. 60 °C, a két primer közt max. 2°C eltérés GC arány: 40-60% 3’ vég utolsó 5 bázisa közül 2-3 G vagy C legyen, az utolsó bázis is G vagy C Bázis és szekvencia ismétlődések: ismétlődő bázisok (ACTTTTTTG): max. 3 bázis & ismétlődő dimerek (TGCACACACACA): max. 2 dimer Másodlagos szerkezetek: ideális esetben nem képeznek, ha mégis, ΔG legyen minél közelebb a 0-hoz Amplikon hossz: 50-200 bp Másodlagos szerkezetek olvadási hőmérséklete < kapcsolódási (annealing) hőmérséklet (ált. 60°C)

Primer tervezés II. 1. nukleotid szekvencia keresése http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore 2. primer tervezés http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 3. primer másodlagos szerkezeteinek ellenőrzése http://www.premierbiosoft.com/qpcr/index.html 4. amplikon másodlagos szerkezeteinek ellenőrzése http://eu.idtdna.com/unafold/Home/Index 5. primer specificitás ellenőrzése

A primer tervezés általános paraméterei I. 1. Product Size – Amplikon mérete Az ideális amplikon mérete 80-150 bázispár 2. Primer Length - Primer hossz Az optimális hossz 18-25 bázispár A hosszabb primerek lassítják a reakciót, kevesebb amplikont eredményeznek  3. Primer Melting Temperature (Tm) - Primer olvadási hőmérséklete Az a hőmérséklet, ahol a primerek fele hibridizálódott a templáttal A primerek olvadási hőmérséklete 57 és 63 °C között legyen, az optimális 60 °C A primer pár tagjainak olvadási hőmérséklete között 1-2 °C eltérés legyen A primerek Tm-je magasabb legyen, mint az amplikon másodlagos struktúráinak olvadási hőmérséklete

A primer tervezés általános paraméterei II. 4. GC arány: 40-60%, opt. 50% A GC arány meghatározza az olvadási hőmérsékletet. A G és C bázisok 3 hidrogén híd kötéssel kapcsolódnak, szemben az A és T bázisokkal, amik 2-vel. A G-C kapcsolat felbontásához nagyobb energia szükséges, ezért minél nagyobb arányban vannak jelen, annál magasabb az olvadási hőmérséklet.  5. 3′ Stability – 3’ stabilitás A 3’ vég utolsó 5 bázisára vonatkozó ΔG érték. A ΔG a Gibbs szabadenergia érték, az az energia, ami szükséges a 3’ vég kötéseinek feltöréséhez. Magasabb 3’ stabilitás javítja a primer hatékonyságát A 3’ végen lévő utolsó 1–2 bázis G vagy C legyen, mert így a primer meghosszabítandó vége stabilabban kötődik 2-3 G vagy C bázis legyen a 3’ vég utolsó 5 bázisában 6. Runs – Nukleotid ismétlődések Az ismétlődő nukleotidok (pl. TAAAAAAAC) szintén rossz kapcsolódáshoz vezethetnek, ezért kerüljük. Maximum 3 legyen egymás mellett  7. Repeats – Dinukleotid szekvencia Ismétlődések Lehetőség szerint kerüljük a dinukleotid ismétlődéseket (pl. TCTCTCTCTC), mert rossz kapcsolódáshoz vezetnek, de ha elkerülhetetlen maximum 4 ismétlődő dinukleotid legyen a primerben

A primerek másodlagos szerkezetei A másodlagos szerkezetek kerülendők, különösen, ha a 3’ véget érintik A stabilitást a ΔG (Gibbs szabadenergia) értékkel jellemzik, minél negatívabb az érték, annál stabilabb, annál nehezebb feltörni a másodlagos szerkezetet Hajtű: 3’ vég: ΔG > of -2 kcal/mol Belső: ΔG > of -3 kcal/mol Saját dimer: két azonos primer között 3’ vég: ΔG > of -5 kcal/mol Belső: ΔG > of -6 kcal/mol Kereszt dimer: forward és reverse primer között Ha elkerülhetetlen a másodlagos szerkezet, olyan primer párt válasszunk, ahol a ΔG értékek legközelebb állnak a 0-hoz A 3’ végen nem kapcsolódhat 2-nél több bázispár! Fontos ellenőrizni az amplikon másodlagos szerkezeteit is, mert ha a kapcsolódási (annealing) hőmérséklet (ált. 60°C) fölött van az olvadási hőmérsékletük, a primerek nem tudnak hozzájuk kapcsolódni

Primer tervezés lépésről lépésre

Példa A kísérlet során egereket etetünk magas zsírtartalmú táppal több héten keresztül A kísérlet végén kíváncsiak vagyunk, hogyan befolyásolta a kezelés a táplálkozást befolyásoló fehérjék génexpresszióját Az agyból szeretnénk kimutatni a táplálkozást serkentő NPY neuropeptid génjéről készült mRNS- eket, ami információval szolgál arról, hogyan változott a kezelés hatására a génexpresszió (Az agyból történő RNS izolálás után az RNS-eket cDNS-sé írjuk át, hogy tudjunk vele qPCR mérést végezni)

I. A minket érdeklő gén megkeresése az adatbázisban http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore

DNS és mRNS közötti különbségek

II. Primerek tervezése Primer-BLAST-tal http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

III. Primerek vizsgálata Beacon Designer szoftverrel http://www.premierbiosoft.com/qpcr/index.html Username: ppkehallgato Password: Hallgato2015

IV. A termék másodlagos szerkezetének vizsgálata UNAFold szoftverrel http://eu.idtdna.com/unafold/Home/Index http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html (reverz komplementer képzése egy lépésben)

V. A primer pár specifitásának ellenőrzése Primer-BLAST-tal http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Feladat Primer pár tervezése egy szabadon választott fehérje génjéhez (saját ötlet is jó). Vigyázat! Az ábrákon nem csak fehérjék szerepelnek!) A faj tetszőlegesen választható (ember, egér, patkány, disznó, stb.) A jegyzőkönyv hasonlóan nézzen ki, mint a példában bemutatott Tartalmazza a faj nevét, gén nevét, refseq kódot, FASTA szekvenciát, A kidobott primerek grafikus megjelenítését Ha a választott primer pár a Beacon Designer szerint jó, és tovább dolgozol vele, akkor a Beacon Designer által kiadott táblázatot (a másodlagos szerkezetek képei nem kellenek) A primer pár tulajdonságait (Primer Blast táblázat) Az UNAFoldban kiadott táblázatot Ha az első tesztelt primer nem jó, a további primereket nézni (elég 3at letesztelni, ha ennyiből nem jön ki jó primer, nem kötelező folytatni a keresést, viszont le kell írni, hogy mit változtatnál a keresési beállításokon) Határidő: a következő gyakorlat (tavaszi szünet után)