GYAKORLATI AUTOANTITEST DIAGNOSZTIKA dr. Mosdósi Bernadett dr. Pálinkás László dr. Berki Tímea

Systemás autoimmun betegség kialakulása Genetikai adottság Előfázis (immunológiai eltérések) ‏ Nem differenciált collagenosis Klasszikus autoimmun betegség (klinikai – laboratóriumi jelekkel) ‏

Természetes és pathológiás autoimmunitás Természetes autoantitestekPathológiás autoantitestek Polireaktívak Alacsony affinitás Ált. IgM ng/ml konc CD5+ B1 sejtek termelik Célantigén: konzervatív strukturák (HSP65,70,90, aldoláz, SOD, citokrómC, aktin, miozin, MBP? DNS, hiszton, vcs ag, TG, ACh R, citokinek, etc Nagy affinitásúak IgG, IgA, IgM típusúak mg/ml szérum koncentráció Érettebb B2 típusú limfociták Célantigén: Szisztémás AI: ált. sejtkomponens ellen Szervspecifikus AI: adott szerv sejte, sejt- komponense, terméke ellen

Kötőszöveti (szisztémás autoimmun) betegségek: –Systemas lupus erythematosus –Primer és secunder antiphospholipid syndroma –Sjögren szindróma –Polymyositis/Dermatomyositis –Systemas sclerosis –Rheumatoid arthritis –Nem differenciált collagenosis –Kevert kötőszöveti betegség („mixed connective tissue disease” = MCTD) –Vasculitisek

Szervspecifikus autoimmun betegségek: –Autoimmun haemolyticus anaemia (AIHA)‏ –Immun neutropenia –Idiopathiás thrombocytopeniás purpura (ITP)‏ –Autoimmun bőrbetegségek –Myasthenia gravis –Demyelinizációs betegségek –Autoimmun perifériás neuropathiák –A gastrointestinalis traktus immunológiai betegségei –Primer biliaris cirrhosis és autoimmun hepatitis –Immunológiai vesebetegségek –A szív immunpathologiai betegségei –Autoimmun pajzsmirigy betegségek –Diabetes mellitus –Egyéb endocrin immunológiai betegségek –Immunológiai tüdőbetegségek –A szem immunpathológiai betegségei

Alkalmazott módszerek Immunfluoreszcencia (IF) ‏ Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ‏ Direkt IF a páciens szövetmintájához kötődött antitesteket vizsgáljuk Indirekt IF a beteg szérumában keringő antitesteket vizsgáljuk szöveten vagy sejten lévő antigénnel Enzimmel (Tormaperoxidáz) jelzett második ellenanyaggal mutatjuk ki a szérumból lekötődött ellenanyagokat. Alkalmas minőségi (screening) és mennyiségi meghatározásra is (a gyári kitekben található ismert koncentrációjú standardok segítségével).

Mi mire alkalmas? Indirekt immunofluorescens kimutatás: –pozitív / negatív eldöntése – szűrés! –festődési mintázat – specificitás felvetése –autoantitest isotípusának meghatározása –autoantitest titerének megadása ELISA –autoantitest titerének megadása –Antigenitás meghatározása Együttes értékelés!

Autoantitest laboratóriumi kimutatásának hasznosítása Diagnosztikus kritérium – „marker autoantitest” Alcsoport, rizikócsoport elkülönítése a kórképen belül Prognózis felállítása Aktív vagy inaktív stádium megítélése (dsDNA)‏ Terápia eredményességének lemérése Több kórkép együttes fennállásának („overlap”) megállapítása

Mire NEM alkalmas az autoantitest meghatározás? Pozitivitás esetén: –diagnózis felállítására (pl.dsDNS+ ≠ SLE). –„Autoimmun betegsége van!” kijelentésére (pl. tumorok, infekciók is okozhatnak pozitivitást)‏ Negativítás esetén: –„Nincs autoimmun betegsége”

ANA screen (anti-nukleáris antitest) ‏ Több különböző autoantitest összefoglaló elnevezése. Sejtmag különböző komponensei ellen. Gold standard: Hep-2 sejteken IIF! dsDNA hiszton centromer SSA/Ro, SSB/La Sm, Sm/RNP Scl-70, Jo-1 Szűrőteszt

dsDNA (kettős szálú DNS) ‏ Crithidia luciliae IF Az anti-dsDNA antitestek az SLE diagnosztikai, aktivitási markere Sok egyéb állapotban is pozitív lehet: elhúzódó gyulladások tumorok sejt széteséssel járó egyéb állapotok Anti-ssDNA (egyes szálú DNS) antitest Kevésbé specifikus, kerülni kell a kimutatását a-dsDNA helyett Mononucleosis Hepatitisz leukémiák

Nukleoszóma Kettősszálú DNS és hiszton fehérjék komplexe A dsDNA elleni antitest eredménnyel összevetve használjuk: natívabb antigén (ssDNA hiánya) ‏ Hiszton fehérjék elleni antitesteket is kimutatja H1, H2A, H2B, H3, H4 SLE korai markere Lupus nephritis Procainamid által kiváltott SLE nem differenciált kollagenosis

ENA Sejtmagban található, kis molekulatömegű nem hiszton típusú nukleoproeinek, ribonukleoproteinek Anti-Sm Anti-Sm/RNP Anti-SS-A/Ro Anti-SS-B/La Anti-Scl-70 Anti-Jo-1 (Extrahálható Nukleáris Antigének) ‏ SLESSPSSMCTDPM/DM 30-50%~95% >15%~87% 30-40% 35-45% - - >30% >20% 20-30% % >25%

Centromer elleni antitest (ACA, CenP-A-B-C) ‏ A kromoszómális kinetochor fehérjekomplex része (a protein A-val és protein C-vel együtt). A sejt osztódásakor a kromoszómának ehhez a részéhez kapcsolódnak a mikrotubulusok. 80 kDa-os fehérje. Progresszív szisztémás scleroderma (PSS) ‏ CREST szindróma (PSS variáns) - Calcinosis - Raynaud fenomén - oEsophagus érintettség - Sclerodactylia - Teleangiectasia Primer Biliaris Cirrhosis (PBC) – gyakran overlap syndroma CREST-el

Anti-Phospholipid antitestek (aPL) ‏ Cardiolipin Wasserman 1906-ban kidolgozott egy szerológiai módszert Syphilis diagnózisára, melyről 1942-ben kiderült, hogy egy foszfolipid, a cardiolipin az aktív komponense es évekre kiderült, hogy sok embernél pozitív ennek a tesztnek az eredménye, anélkül, hogy syphilisesek lennének (biológiai álpozitivitás). Ebben a csoportban sok volt az autoimmun elváltozás: SLE, Sjögren szindróma. Anti-Phospholipid Syndroma 1952-ben dokumentáltak először keringő antikoagulánsokat SLE-s betegekben (paradox thrombosis!) – Lupus anticoagulans (LA) ‏

Anti-Phospholipid antitestek Cardiolipin Indikációk: SLE Thrombosis Thrombocytopenia Cerebralis ischaemia Chorea Epilepszia gyakori vetélés intrauterin elhalás Anti-Cardiolipin IgM- kórképek kezdeti szakaszában Anti-Cardiolipin IgG- progersszív stádiumban Anti-Cardiolipin IgA- az afrikai populációban érdekes

Anti-Phospholipid antitestek  2 glikoprotein I ( b2GP) ‏ A foszfolipid kötő fehérjék közül a  2 glikoprotein I a legtöbbet vizsgált. Jól ismert cofaktora az anti-cardiolipin autoantitesteknek. Bizonyított, hogy csak jelenlétében tud kötődni az antitest az immobilizált cardiolipinhez. SLE thrombosis, thrombembolia intrauterin elhalás, abortusok Anti- b2 glikoprotein I IgM- kórképek kezdeti szakaszában Anti- b2 glikoprotein I IgG- progersszív stádiumban, jól korrelál a klinikai statussal

Anti-Phospholipid antitestek Phosphatidyl Serine (PS) ‏ Egy másik negatív töltésű foszfolipid, mely ellen termelődött autoantitestek detektálása még specifikusabb diagnózist tesz lehetővé. Nem helyettesíti a cardiolipin tesztet. Prothrombin A prothrombin (Factor II) ellenes antitestek jelenléte fokozott véralvadási hajlamot okoz, myocardiális infarktus kockázatát növeli.

Alfa-Fodrin A fodrin az eukariota citoszkeleton aktin kötő fehérjéje. Alfa és béta egységből áll. Apoptózis során az alfa alegység 120 kDa-os alegységre hasítódik, amely stimulálja a perifériás T-sejteket. Az alegység mindenhol megtalálható a verejtékmirigyekben. Anti-alfa-fodrin autoantitest kimutatható: Primer és secunder Sjögren syndroma korai stádiumban specifikus marker juvenilis SLE ! juvenilis RA!

ANCA c-ANCA: diagnosztikus, aktivítási marker Granuláris citoplazmális mintázat IF-el. A célantigén 80-90%-ban a proteináz 3 (PR3), egy szerin proteáz a neutrofilok a-granulomából Wegener Granulomatosis mikroszkópos poliarteritis Churg-Strauss szindróma p-ANCA Perinucleáris mintázat IF-el. A célantigén 90%-ban a myeloperoxidáz (MPO) ‏ poliarteris nodosa idiopathiás „crescent” glomerulonephritis (anti-neutrofil citoplazmáris antitestek) ‏ Atípusos ANCA: nem diagnosztikus értékű ! PSC, CU,

ASCA (Anti-Saccharomyces cerevisiae antitest) ‏ A célantigén a Saccharomyces cerevisiae (élesztő) sejtfali mannózának oligomannozid epitópja ellen (foszfopeptidomannán). Chron betegség Colitis ulcerosa ASCA IgG- 75%10-20% ASCA IgA-60% 0-10% pANCA-5-20% 70%

Endomysium, tTG Endomysium Endomysium ellenes antitestek (IgA, IgG) kimutathatók: Coeliakia Dermatitis herpetiformis Rendkívül specifikus (99%) ‏ Kvantítatív meghatározás is kell! tTG A szöveti transzglutamináz (tTG) a legfontosabb (ha nem az egyetlen) antigénje az endomysium ellenes antitesteknek. Nagyon szenzitív és specifikus marker. IgA a legfontosabb izotípus, de a szelektív IgA hiány tünetszegénysége és gyakorisága miatt az IgG izotípust is keressük!

Gliadin Búzában, árpában és rizsben található fehérjének 7 kDa-os peptidje. Gliadin ellenes antitest előfordul: Ceoliákia Dermatitis herpetiformis Az ellenanyag keresztreagál: - enterocitákkal, - kalretikulinnal A hosszú ideig fennálló coeliákia predisponál: - gastrointestinális neoplazmára, - lymphomára, - más autoimmun betegségekre (diabetes, RA, autoimmun hepatitis vagy thyroiditis) ‏

GBM (Glomerulus bazálmembrán) ‏ Goodpasture szindróma Diagnosztikus vizsgálatok: - anti-GBM IgG - a IV. típusú kollagén alfa-3 láncának C terminális vége elleni antitest Antitest titere tükrözi az aktivitást anti-GBM IgG negatív - kizárja az aktív Goodpasture-t anti-GBM IgG pozitív - azonnali kezelés kell a fenyegető tüdővérzés és a rossz prognózis miatt

Rheuma factor (RF) ‏ IgG Fc része elleni termelödő immunglobulin 75-80%-ban pozitív RA betegekben RF található még a következő entitásokban: infekciók autoimmun betegségek: Sjögren sy hyperglobulinaemia B-sejtes lymphoproliferatív betegségek idős kor IgM RF – articularis tünetek, rheumás csomók, nem jellemző szisztémás betegségben IgA RF – jó prognosztikai jel IgG RF - rheumatoid vasculitis

CCP, MCV CCP – ciklikus citrullinált peptid Citrullináció a peptidyl arginin deimináz (PAD) enzim által katalizált folyamat, melyben az arginin (Arg) aminosav citrullinná módosul, a pozitív töltésű –NH 2 csoport hidrolizálódik egy oxigén csoporttal. RA a korai, nagyon specifikus markere! MCV – mutált citrullinált vimentin A vimentint a macrophagok gyulladásos szignál hatására az izületi folyadékba szekretálják és módosítják. RA korai és specifikus markere

Anti-mitochondriális antitestek (AMA) ‏ Hiszton – FITC Mitokondrium - PE Heterogén antigének a mitokondrium külső- vagy belső membránban. 9 különféle alcsoport, melyek eltérő betegségekben pozitívak: AMA-M1- Lues-II AMA-M2, -M4, -M8,-M9- Primer Biliáris Cirrhosis (PBC) ‏ M2, M9 – kezdődő PBC M2, M4, M8 – progresszív esetek AMA-M3- gyógyszer indukálta SLE AMA-M5- SLE, differenciálatlan kollagenózis, autoimmun haemolitikus anaemia AMA-M6- gyógyszer indukálta hepatitisz AMA-M7- cardiomyopathia, myocarditis

GPC (Gastric parietal cell – Gyomor parietális sejt) ‏ H/K ATPáz (protonpumpa) a célantigén, amely a parietális sejtek sósavtermeléséért felelős transzport fehérje. Két szubunitból áll és nagyon konzerválódott az aminosav sorrendje a törzsfejlődés során. Intrinsic factor I. Típusú anti-Intrinsic factor antitest II. Típusú anti-Intrinsic factor antitest A fehérje cobalamin kötő helyéhez kötődve megakadályozza a B12 vitamin megkötését. Az intrinsic factoron más epitópokhoz kötődik és megakadályozza a felszívódását a terminális ileumban Anaemia perniciosa

TG, TPO Tireoglobulin (TG), Thyroidea peroxidáz (TPO) ‏ golyva atrófiás tireoiditisz primer tireotoxikózis Hashimoto tiroiditisz Graves betegség ritkán pajzsmirigy adenomához vagy karcinomához társulva TPO: aktivitás

Diabetes mellitus Glutamin acid decarboxylase (GAD65) I. Tipusú diabetes mellitus kezdeti szakaszában mutatható ki Tyrosine phosphatase (IA2)‏ 50-75%-ban fordul elő 1-es típusú diabetesben (IDDM)‏

GM, MAG, AchR elleni ab Gangliozid (GM1, GD1b, Gq1b)elleni antitest –AI perifériás neuropathia, GM1: Gullain-Barre sy, Gq1b:Miller- Fischer sy Myelin asszocialt glikoprotein elleni antitest –Szenzo-motoros perifériás neuropathia Ach receptor elleni antitest –Myasthenia gravis –Izotópos immunoasay

Tct elleni, Vvt elleni antitest Thrombocyta elleni antitest –ITP Vörösvérsejt elleni antitest - Autoimmun hemolitikus anaemia - meleg típusú AIHA: IgG, extravascularis hemolizis Coombs reakció Szisztémás AI betegség Gyógyszer indukálta - hideg típusú AIHA: IgM, intravazalis hemolizis infekció: Mycoplasma, vírusinfekciók lymphoproliferatív kórképek

Mikor mit kérjek? 1. Korai arthritis esetén: –CCP – korai RA –Alfa-Fodrin – korai Sjögren sy –DsDNS – korai SLE –ANCA – induló vasculitis Ha SSc gyanúja áll fenn: –ANA – HEp-2 –Scl-70 – diffúz scleroderma –ACA – limitalt scleroderma –SSA, SSB – Sjögren overlap –Anti-cardiolipin screen

SLE gyanúja esetén: –ANA – HEp-2. –DsDNS: betegség aktivitásával összefügg –Anti-nukleosoma dsDNS neg. esetekben is pozitív lehet Szintén aktivitás marker. –Anti-Sm: veseérintettség –Anti-C1q: veseérintettség –Anti-foszfolipid antitest szűrés: Anti-cardiolipin screen Lupus anti-koagulans –Anti-SSA subacut cutan LE Congentialis szívblokk –anti-SSB – Sjögren overlap –Anti-hiszton – gyógyszer indukálta SLE

Myositis gyanú esetén: –ANA –Anti-Jo-1 Anti-foszfolipid szindróma gyanúja esetén: –Elsőként: Cardiolipin screen Lupus antikoagulans dsDNS – SLE kizárására –Negatívitás esetén: Beta2-glicoprotein-1 Örökletes trombofiliák

Összefoglalás Nincs immunpanel! Klinikum alapján kérdezzünk Az összkép alapján ítéljünk Szükség esetén konzultáció