Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az RNS világ, hibaküszöb Kun Ádám Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék és Collegium Budapest.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az RNS világ, hibaküszöb Kun Ádám Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék és Collegium Budapest."— Előadás másolata:

1 Az RNS világ, hibaküszöb Kun Ádám Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék és Collegium Budapest

2 Az Élet kialakulása előtt... Az első élőlények rendelkeztek Az első élőlények rendelkeztek –Sejtmembránnal –Anyagcserével –Örökítőanyaggal Hogy jutottunk el idáig? Hogy jutottunk el idáig? Mi volt az ősleves (pizza) és az első élőlények közötti időben? Mi volt az ősleves (pizza) és az első élőlények közötti időben?

3 Mi volt előbb a tyúk vagy a tojás? Fehérje enzimek Fehérje enzimek DNS örökítőanyag DNS örökítőanyag Lipid membrán Lipid membrán

4 RNS világ Az RNS lehet enzim és információhordozó DNS és fehérje világ előtt RNS világ A DNS stabilabb a fehérje pedig változatosabb és hatékonyabb enzim

5 RNS világ 1. RNS világ bizonyítékai 2. RNS világ lehetőségei 3. RNS világ kialakulásának megoldatlan problémái 4. RNS világ fejlődésének problémái

6 RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában I Természetes RNS enzimek (ribozim) Mindegyik RNS hasítást katalizál –I. Csoportbeli intronok –II. Csoportbeli intronok –RNáz P –Kalapácsfej –Hajtűhurok –Hepatitis Delta Vírus –Neurospora Varkund Satelite RNA Joyce, G. (2002) Nature 418: alapján

7 RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában II: Koenzimek Koenzimek: valamilyen specifikus kémiai csoport átadásában résztvevő metabolitok (rengeteg reakcióban) – –Acetyl koenzim A (koenzim A): acetyl csoport – –NADH, FADH 2 (NAD +, FAD): hidrogén és elektron – –ATP (ADP): nagyenergiájú foszfát ATP CoA FAD NADP NAD

8 tRNS Aminosavat szállít a transzlációhoz Aminosavat szállít a transzlációhoz Lehet koenzim is! Lehet koenzim is! Glutamil-tRNA + 2 H NADPH L-Glutamát-1-félaldehid + NADP + + tRNA Glu

9 RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában III Dezoxi-ribonukleotidok ribonukleotidokból keletkeznek (de ezt valószínűleg ribozimek nem tudják katalizálni). Dezoxi-ribonukleotidok ribonukleotidokból keletkeznek (de ezt valószínűleg ribozimek nem tudják katalizálni). Riboswitches: Génreguláció vélhetően legősibb formája. Az mRNS térszerkezete határozza meg, hogy lefordítódik fehérjévé. Riboswitches: Génreguláció vélhetően legősibb formája. Az mRNS térszerkezete határozza meg, hogy lefordítódik fehérjévé.

10 RNS világ bizonyítékai a mai szervezetek biokémiájában IV: Transzláció mRNS mRNS tRNS tRNS riboszóma riboszóma A DNS  fehérje „átmentet” (transzláció) RNS közvetítésével történik Riboszómában a peptidil transzfert egy ribozim végzi!

11 RNS világ lehetőségei Mesterséges evolúcióval előállított enzimek SZINTÉZIS v. VÉLETLENSZERŰ MOLEKULÁK SZELEKCIÓ Affinity chromatography Filter binding Gel mobility shift Imunopercipitation SOKSZOROZÓDÁS mutagenic PCR EVOLVÁLÓDOTT MOLEKULA

12 RNS világ lehetőségei: RNS szintézis Nukleotid képzés pirimidinből és aktivált ribózból Nukleotid képzés pirimidinből és aktivált ribózból Polinukleotidok 5’ foszforilációja Polinukleotidok 5’ foszforilációja 5’ foszfát aktiválása 5’,5’ pirofoszfát kötött nukleotid kapcsolással 5’ foszfát aktiválása 5’,5’ pirofoszfát kötött nukleotid kapcsolással Ligáz aktivitás Ligáz aktivitás Legjobb szintetáz kb. 200 bázis hosszú és 14 nuklotidot tud egy templát alapján hozzákapcsolni egy oligonukleotid lánchoz 97.5%-os másolási hűséggel. Legjobb szintetáz kb. 200 bázis hosszú és 14 nuklotidot tud egy templát alapján hozzákapcsolni egy oligonukleotid lánchoz 97.5%-os másolási hűséggel.

13 RNS világ lehetőségei: Protein szintézis Protein szintézis minden lépése megoldható Aminosavak aktiválása (sokféle aminoaciláció) Aminosavak aktiválása (sokféle aminoaciláció) Peptid kötés kialakítás Peptid kötés kialakítás

14 RNS világ lehetőségei : Egyéb reakciók amid kötés bontás amid kötés bontás alkiláció alkiláció porfirin metiláció porfirin metiláció kén alkiláció kén alkiláció Diels-Alder cikloaddíció Diels-Alder cikloaddíció Amid kötés kialakítás Amid kötés kialakítás hidas bifenil izomeráció hidas bifenil izomeráció

15 RNS világ lehetőségei : Érdekességek Egy ribozim a részeiből is összeállhat működő ribozimmé E. coli RNáz P M1 részét darabolva, azok összeállnak működő ribozimet alkotva. Kisebb részleteket jobban lehet replikálni Egy szekvencia, két ribozim HDV-t és class III ligáz-t egyesítő ribozimet állítottak elő, úgy, hogy olyan szekvenciát kerestek, amely mindkét szerkezetet felveheti. Működő enzimeken keresztül vezethet az út egyik funkcióból a másikba

16 RNS világ kialakulásának megoldatlan problémái Rengeteg féle cukor, bázis Rengeteg féle cukor, bázis Sztereokémia Sztereokémia Pirimidinek prebiotikus keletkezése kérdéses Pirimidinek prebiotikus keletkezése kérdéses Nukleotidok képződésének sebessége nagyon kicsi Nukleotidok képződésének sebessége nagyon kicsi Polimerizáció során 2’-5’; 3’-5’ és 5’-5’ kapcsolatok Polimerizáció során 2’-5’; 3’-5’ és 5’-5’ kapcsolatok

17 Az RNS világ fejlődése Tekintsünk el az előbbi problémáktól! Tekintsünk el az előbbi problémáktól! Legyen aktivált monomerünk. Legyen aktivált monomerünk. Legyenek oligonukleotidjaink Legyenek oligonukleotidjaink Hogyan alakulhat ki ebből egy RNS világ?

18 Az RNS világ fejlődése: Az Eigen paradoxon A replikáció nem hibátlan (főleg nem replikáz és javító mechanizmusok nélkül) A replikáció nem hibátlan (főleg nem replikáz és javító mechanizmusok nélkül) Mekkora információ (milyen hosszú RNS szál) tartható meg adott másolási pontosság mellett? Mekkora információ (milyen hosszú RNS szál) tartható meg adott másolási pontosság mellett?

19 „Replikáció” egy példája RNA RGA RNA RNX RNA RNH DNM RNA RQA RNA RNJ RPA WORLD WORLF WORLD WORLL IDRYD WORLD KORLD WORLD WORUD WORLD WORHD WORLD WORWD WORLD WRRLD HYPOTHESIS EYPKTHYSII HYPEXHESIS HYPOTHESIS HYPETHESKS HYYOTHESIS HYPOTHESIS HYPOSHESIS HYPOTMESIS HTPOTHESIS CYPOTGESIS HYPOTHEGIA HYPOXHLSIS HYPXTHESIS HYPOTHESIS HYPUTHESIS

20 Az Eigen paradoxon: Modell x i molekula conc. x i molekula conc. A i másolási sebesség A i másolási sebesség w ij mutáció j-ből i-be w ij mutáció j-ből i-be D és  az állandó kocentrációért D és  az állandó kocentrációért Q a másolási hűség, Q=q N Q a másolási hűség, Q=q N q a bázisonkénti másolási hűség q a bázisonkénti másolási hűség

21 Eigen paradoxon: A paradoxon Együtt tud-e élni egy mesterkópia, a mutánsaival? Együtt tud-e élni egy mesterkópia, a mutánsaival? ahol s az eredeti szekvencia szelekciós fölénye ahol s az eredeti szekvencia szelekciós fölénye Hosszabb RNS-hez jobb (hosszabb enzim kell), de a hosszabb enzimet nem tudja megtartani a rendszer Hosszabb RNS-hez jobb (hosszabb enzim kell), de a hosszabb enzimet nem tudja megtartani a rendszer Tehát mondjuk 97.5% pontossággal másoló 200 nukleotidból álló replikáz nem tudja fenntartani saját magát.

22 Hibaküszöb Swetina és Schuster 1998 alapján N=50

23 Genotípus - Fenotípus Genotípus a szekvencia (bázissorrend) Genotípus a szekvencia (bázissorrend) A fenotípus az Eigen modellben szintén a bázissorrend A fenotípus az Eigen modellben szintén a bázissorrend AUCGUCUGUCGGCGAU GCAUGACUCAUUAUGC A két szekvencia teljesen különbözik. A mutáns fitnesse 0 Mesterkópia: Mutáns:

24 RNS struktúra Neurospora VS ribozim 144 nukleotid hosszú

25 RNS másodlagos szerkezet Bázispárok számától függ a szabadenergia. Bázispárok számától függ a szabadenergia. Dinamikus optimalizáció a bázispárok számának maximalizálására (energia minimalizálására) Dinamikus optimalizáció a bázispárok számának maximalizálására (energia minimalizálására) A bázispárok energetikáját kísérletesen vizsgálják A bázispárok energetikáját kísérletesen vizsgálják

26 RNS másodlagos szerkezet meghatározás Szekvencia R=r 1, r 2, r 3,..., r n ; ahol r i  {A,C,G,U} Másodlagos szerkezet S = i.j bázispárok rendezett halmaza 1.1  i < j  N 2. j - i>3 3.i.j és k.l bázispárokra (i

27 Másodlagos szerkezet energiája hajtűkanyar halmozódó bázispár kitüremkedésbelső hurok elágazás A srtruktúra energiája a hurkok energiájától függ Bármely struktúra egyértelműen felbontható m+1 (m a bázispárok száma) hurokra A struktúra energiája, így az egyes hurkok energiájának összege

28 Struktúra a fenotípus A másolási sebesség, vagy az enzimatikus aktivitás a struktúrától függ. A másolási sebesség, vagy az enzimatikus aktivitás a struktúrától függ. Egy RNS molekula fenotípusa nem a bázissorrend, hanem a struktúra. Egy RNS molekula fenotípusa nem a bázissorrend, hanem a struktúra. 4 N szekvencia lehetséges, mennyi struktúra? 4 N szekvencia lehetséges, mennyi struktúra? Hogyan határozzuk meg a struktúrát Hogyan határozzuk meg a struktúrát

29 RNS tájképek Kémiailag és fizikailag megalapozott genotípus-fenotípus térkép Kémiailag és fizikailag megalapozott genotípus-fenotípus térkép Ilyen máshol még nincs a biológiában Ilyen máshol még nincs a biológiában

30 RNS tájképek tulajdonságai I Körülbelül 2.35 N struktúra, azaz egy struktúrához több szekvencia tartozik. Körülbelül 2.35 N struktúra, azaz egy struktúrához több szekvencia tartozik. Kevés mutáció (1-3) általában nem változtatja meg a struktúrát Kevés mutáció (1-3) általában nem változtatja meg a struktúrát Ha van egy kompatibilis szekvenciánk, akkor az átlagosan 7.2 mutációval olyanná alakítható, hogy kívánt MFE struktúrája legyen Ha van egy kompatibilis szekvenciánk, akkor az átlagosan 7.2 mutációval olyanná alakítható, hogy kívánt MFE struktúrája legyen

31 RNS tájképek tulajdonságai II AUCGUCUGUCGGCGAU GCAUGACUCAUUAUGC Mesterkópia: Mutáns: Semleges utak a tájképen Az utak 21.7%-a perkolál Azonos struktúra Azonos fitness

32 RNS tájképek tulajdonságai III Vannak gyakoribb struktúrák Vannak gyakoribb struktúrák A szekvenciák zöme gyakori struktúrát vesz fel ( evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakoriak ) A szekvenciák zöme gyakori struktúrát vesz fel ( evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakoriak ) A struktúrák zömét csekély számú szekvencia veszi fel A struktúrák zömét csekély számú szekvencia veszi fel Minden szekvencia körüli kb. 20 mutációval elérhető gömbön belül minden gyakori struktúra elérhető Minden szekvencia körüli kb. 20 mutációval elérhető gömbön belül minden gyakori struktúra elérhető

33 RNS tájképek következményei Az evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakori struktúrák. Az evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakori struktúrák. A hibaküszöböt egy megengedőbb fenotípikus hibaküszöb váltja fel. A hibaküszöböt egy megengedőbb fenotípikus hibaküszöb váltja fel. Az Eigen paradoxont ez nem oldja meg, de megoldását könnyebbé teszi. Az Eigen paradoxont ez nem oldja meg, de megoldását könnyebbé teszi.

34 Ribozimok rátermettség tájképe A fenotipikus hibaküszöb becsléséhez szükségünk van egy rátermettség tájképre A fenotipikus hibaküszöb becsléséhez szükségünk van egy rátermettség tájképre A rátermettség tájkép kísérletes adatokra épül A rátermettség tájkép kísérletes adatokra épül Feltételezzük, hogy az enzimaktivitás arányos a rátermettséggel (protosejt) Feltételezzük, hogy az enzimaktivitás arányos a rátermettséggel (protosejt)

35 A vizsgálat célja 1. Valós ribozimokra rátermettség tájkép szerkesztése 2. Ilyen tájkép előállításának általános menete 3. Fenotipikus hibaküszöb becslése

36 Mely ribozimok jöhetnek szóba? 1. Jól karakterizált Csak a természetes ribozimok teljesítik ezt a kritériumot 2. Nem túl hosszú (praktikus ok) Az I-es és II-es csoportbeli intronok kiesnek 3. Nem lehet a transz ható enzim szerkezetben pszeudo-csomó (algoritmus követelménye) Hepatitis Delta Virus kiesik e miatt Neurospora VS Ribozyme, Hairpin, Hammerhead

37 Neurospora Varkund Satellit Ribozim N = 144 A pozíciók 83/144 (57%) mutálva van, mi összesen 183 mutánst vettünk figyelembe

38 VS Ribozim: mutációs kísérletek 144 nukleotidból 87-en végeztek mutációs kísérletet Összesen 183 mutánst vizsgáltak

39 VS Ribozim Aktív hely Szubsztrát kötés Hossz nem fontos Elágazások fontosak Kitüremkedés nem lehet a másik száron, de törölhető

40 Hairpin Ribozyme N = 50 A pozíciók 39/50 (78%) mutálva van, összesen 142 mutáns vettünk figyelembe

41 Ribozimokkal kapcsolatos általános megfigyelések 1. A szerkezet a fontos, nem az egyedi bázispárok 2. A szerkezet kissé változtatható 3. Vannak kritikus helyek 4. A tájkép multiplikatív (lehet hogy van egy gyenge szinergia)

42 Általános funkcionalitás tájkép Rendeljen minden lehetséges 4 N szekvenciához egy relatív enzimaktivitást I.Kompatibilis szerkezet II.Hibás bázispár III.Kritikus helyek IV. Jósolt struktúra

43 I. Kompatibilis szerkezet A célstruktúrának megfelelő bázis-párok mindegyike – legtöbbje – ki tud-e alakulni? A célstruktúrának megfelelő bázis-párok mindegyike – legtöbbje – ki tud-e alakulni? Néhány hibás pár (rosszul párosított bázispár) megengedhető, de Néhány hibás pár (rosszul párosított bázispár) megengedhető, de –Nem lehet kettő ilyen egymás mellett –Nem lehet egy régióban kettőnél több A a szekvenciával kompatibilis struktúrának megfelelő aktivitás. A a szekvenciával kompatibilis struktúrának megfelelő aktivitás.

44 II. Hibás bázispárok Minden megengedett hibás bázis-pár csökkenti az aktivitást Minden megengedett hibás bázis-pár csökkenti az aktivitást Az elhelyezkedésüktől függően más hatásuk lehet az egyes hibás pároknak Az elhelyezkedésüktől függően más hatásuk lehet az egyes hibás pároknak

45 III. Kritikus helyek Minden lehetséges nukleotidhoz rendelünk aktivitást ezeken a helyeken. Minden lehetséges nukleotidhoz rendelünk aktivitást ezeken a helyeken.

46 IV. Jósolt szerkezet A 2D szerkezet meghatározása. (Vienna RNA Package) A 2D szerkezet meghatározása. (Vienna RNA Package) Elfogadjuk, ha a célszerkezetbe tekeredik. Elfogadjuk, ha a célszerkezetbe tekeredik. A MFE nem biztos, hogy a kísérletesen meghatározott másodlagos szerkezet A MFE nem biztos, hogy a kísérletesen meghatározott másodlagos szerkezet

47 RNS populáció dinamikája 1000 RNS molekula 1000 RNS molekula Szaporodás esélye arányos a fitnesszel Szaporodás esélye arányos a fitnesszel A másolás pontatlan, de a molekula hossza állandó A másolás pontatlan, de a molekula hossza állandó Degradáció sebessége azonos minden szekvenciára Degradáció sebessége azonos minden szekvenciára

48 A tájkép tulajdonságai = 0.26 = 0.22

49 Fenotipikus hibaküszöb  * =  * = VS RibozimHajtű

50 Más tájképekkel összehasonlítva 1. Mnt. Fuji típusú tájkép –Nincs szerkezet –Az aktivitások pontmutációk alapján 2. Egycsúcsú rátermettség tájkép  Az egyszeres mutánsok átlagos aktivitása alapján

51 Más tájképekkel összehasonlítva

52 Fenntartható genom méret Neurospora VS Ribozim Hairpin A két funkcionalitás tájképe eléggé hasonló, így az lns értékeket használhatjuk a fenntartható genomméret becslésére.

53 Fenntartható genom méret

54 Probléma még egyáltalán Eigen Paradoxona?


Letölteni ppt "Az RNS világ, hibaküszöb Kun Ádám Növényrendszertani és Ökológiai Tanszék és Collegium Budapest."

Hasonló előadás


Google Hirdetések