Lipáz enzimaktivtás mérése

Az előadások a következő témára: "Lipáz enzimaktivtás mérése"— Előadás másolata:

1 Lipáz enzimaktivtás mérése

2 Lipidek Vegyületek heterogén csoportja Vízoldhatatlan
Organizmusokban általában fehérjékkel (lipoproteinek), szénhidrátokkal (liposzaharidok) képzett vegyületei fordulnak elő A lipidek nagy része triglicerid formájában kerül a talajba A lebontás első lépését a lipáz (triglicerid-acilhidroláz) enzim végzi A reakció során zsírsavak és glicerin szabadul fel

3 Zsírsavak Hosszú szénláncú karbonsavak
Lehetnek telített-, telítetlen-, keto-, hidroxi-, epoxi-, elágazó szénláncú, vagy gyűrűs, savak. A leggyakoribbak a telítetlen zsírsavak cisz izomerjei

4 Zsírsavak bontása Aerob környezetben
β-oxidáció: 2 szénatomos darabok lehasadásával bomlanak, melynek végterméke CO2 és víz Ritkább esetben α-, vagy σ-oxidáció megy végbe. Ez esetben az oxidáció nem teljes Anaerob környezetben a zsírsavak feldúsulnak a környezetben

5 Az enzimaktivitás mérésének kivitelezése

6 Az eljárás alapelve A talajt 4-metil-umbelliferon-heptanoáttal (4- MUH) inkubáljuk 10 percen át 30°C-on. A talaj lipáz aktivitására a felszabaduló, fluoreszcens 4-metil-umbelliferon (4-MU) mennyiségéből következtethetünk. Szükséges anyagok és felszerelések: Fluoriméter Rázó vízfürdő Centrifuga, centrifuga csövek (10 ml) Erlenmeyer lombikok (25 ml)

7 Szükséges vegyületek, oldatok
Etilén-glikol-monometil-éter 4-MUH (10mM) Oldjunk fel 58 mg 4-MUH-t 10 ml etilén-glikol-monometil-éterben, majd töltsük fel ugyanezzel az oldószerrel 20 ml-re (tárolás -20°C-on). Az oldatot naponta készítsük el! TRIS (2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol) puffer (0,1 M, pH 7,5) 12,11 g TRIS-t oldjunk fel 700 ml desztillált vízben, 0,1M sósavval állítsuk a pH-t 7,5-re, majd töltsük fel 1000 ml-ig desztillált vízzel 4-MU standard oldat 176 mg MU-t feloldunk 70 ml etilén-glikol-monometil-éterben, , majd feltöltjük ugyanezzel az oldószerrel 100 ml-re. Az oldat 4 °C-on több napig eláll.

8 Az eljárás Helyezzünk 0,1 g nedves talajmintát 25 ml-es Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 4,5 ml TRIS puffert, zárjuk le és inkubáljuk 30°C-on rázó vízfürdőben 10 percig Adjunk hozzá 0,5 ml 4-MUH szubsztrátot, rázzuk jól össze, zárjuk le és ismét inkubáljuk 30°C-on rázó vízfürdőben 10 percig Ezután jeges vízbe helyezve a lombikot, hűtsük le a mintákat Kontroll minta készítéséhez adjuk a szubsztrát odatot a talaj szuszpenzióhoz amint a lombikot hűteni kezdjük Ezután 2°C-on 4000 g-n centrifugáljuk a mintákat Spektrofluorimetriával vizsgáljuk a felülúszóban a felszabadult 4-MU mennyiségét (gerjesztési hullámhossz: 340 nm, emissziós hullámhossz: 450 nm)

9 Kalibrációs görbe Hígítsuk a desztillált vízzel a 4-MU standard oldatot (1:100) Helyezzünk 0,1 g talajmintát Erlenmeyer lombikba és adjunk hozzá 4,5 ml TRIS puffert, illetve 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 és 0,5 ml 4-MU standard oldatot Adjunk 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 és 0 ml desztillált vizet az oldatokhoz, hogy kiegészítsük 5 ml-re Folytassuk „Az eljárás” dián leírtak szerint A standardek koncenjtrációja 0, 10, 20, 30, 40, 50 nM A kalibrációs görbét minden talajmintához külön kell elkészíteni

10 Számítás Korrigáljuk az eredményeket a kontroll minta alapján
Számítsuk az enzimiaktivtást a a következő képlet alapján: Ahol U az enzimaktivitás (nM×g-1×dwt-1×10 min-1), MU a mért 4-MU koncentráció nmol/l-ben, dwt a 1 g talajminta száraz tömege, 0,1 a felhasznált talajminta száraz tömege.

11 Forrás Alef, K.; Nanniperi, P.: Methods in Applied Soli Microbiology and Biochemistry, 1995