Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Lipáz enzimaktivtás mérése. Lipidek Vegyületek heterogén csoportja Vízoldhatatlan Organizmusokban általában fehérjékkel (lipoproteinek), szénhidrátokkal.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Lipáz enzimaktivtás mérése. Lipidek Vegyületek heterogén csoportja Vízoldhatatlan Organizmusokban általában fehérjékkel (lipoproteinek), szénhidrátokkal."— Előadás másolata:

1 Lipáz enzimaktivtás mérése

2 Lipidek Vegyületek heterogén csoportja Vízoldhatatlan Organizmusokban általában fehérjékkel (lipoproteinek), szénhidrátokkal (liposzaharidok) képzett vegyületei fordulnak elő A lipidek nagy része triglicerid formájában kerül a talajba A lebontás első lépését a lipáz (triglicerid-acilhidroláz) enzim végzi A reakció során zsírsavak és glicerin szabadul fel

3 Zsírsavak Hosszú szénláncú karbonsavak Lehetnek telített-, telítetlen-, keto-, hidroxi-, epoxi-, elágazó szénláncú, vagy gyűrűs, savak. A leggyakoribbak a telítetlen zsírsavak cisz izomerjei

4 Zsírsavak bontása Aerob környezetben – β-oxidáció: 2 szénatomos darabok lehasadásával bomlanak, melynek végterméke CO 2 és víz – Ritkább esetben α-, vagy σ-oxidáció megy végbe. Ez esetben az oxidáció nem teljes Anaerob környezetben a zsírsavak feldúsulnak a környezetben

5 AZ ENZIMAKTIVITÁS MÉRÉSÉNEK KIVITELEZÉSE

6 Az eljárás alapelve A talajt 4-metil-umbelliferon-heptanoáttal (4- MUH) inkubáljuk 10 percen át 30°C-on. A talaj lipáz aktivitására a felszabaduló, fluoreszcens 4-metil-umbelliferon (4-MU) mennyiségéből következtethetünk. Szükséges anyagok és felszerelések: – Fluoriméter – Rázó vízfürdő – Centrifuga, centrifuga csövek (10 ml) – Erlenmeyer lombikok (25 ml)

7 Szükséges vegyületek, oldatok Etilén-glikol-monometil-éter 4-MUH (10mM) – Oldjunk fel 58 mg 4-MUH-t 10 ml etilén-glikol-monometil- éterben, majd töltsük fel ugyanezzel az oldószerrel 20 ml-re (tárolás -20°C-on). Az oldatot naponta készítsük el! TRIS (2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol) puffer (0,1 M, pH 7,5) – 12,11 g TRIS-t oldjunk fel 700 ml desztillált vízben, 0,1M sósavval állítsuk a pH-t 7,5-re, majd töltsük fel 1000 ml-ig desztillált vízzel 4-MU standard oldat – 176 mg MU-t feloldunk 70 ml etilén-glikol-monometil-éterben,, majd feltöltjük ugyanezzel az oldószerrel 100 ml-re. Az oldat 4 °C-on több napig eláll.

8 Az eljárás Helyezzünk 0,1 g nedves talajmintát 25 ml-es Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 4,5 ml TRIS puffert, zárjuk le és inkubáljuk 30°C-on rázó vízfürdőben 10 percig Adjunk hozzá 0,5 ml 4-MUH szubsztrátot, rázzuk jól össze, zárjuk le és ismét inkubáljuk 30°C-on rázó vízfürdőben 10 percig Ezután jeges vízbe helyezve a lombikot, hűtsük le a mintákat Kontroll minta készítéséhez adjuk a szubsztrát odatot a talaj szuszpenzióhoz amint a lombikot hűteni kezdjük Ezután 2°C-on 4000 g-n centrifugáljuk a mintákat Spektrofluorimetriával vizsgáljuk a felülúszóban a felszabadult 4-MU mennyiségét (gerjesztési hullámhossz: 340 nm, emissziós hullámhossz: 450 nm)

9 Kalibrációs görbe Hígítsuk a desztillált vízzel a 4-MU standard oldatot (1:100) Helyezzünk 0,1 g talajmintát Erlenmeyer lombikba és adjunk hozzá 4,5 ml TRIS puffert, illetve 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 és 0,5 ml 4-MU standard oldatot Adjunk 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 és 0 ml desztillált vizet az oldatokhoz, hogy kiegészítsük 5 ml-re Folytassuk „Az eljárás” dián leírtak szerint A standardek koncenjtrációja 0, 10, 20, 30, 40, 50 nM A kalibrációs görbét minden talajmintához külön kell elkészíteni

10 Számítás Korrigáljuk az eredményeket a kontroll minta alapján Számítsuk az enzimiaktivtást a a következő képlet alapján: Ahol U az enzimaktivitás (nM×g -1 ×dwt -1 ×10 min - 1 ), MU a mért 4-MU koncentráció nmol/l-ben, dwt a 1 g talajminta száraz tömege, 0,1 a felhasznált talajminta száraz tömege.

11 Forrás Alef, K.; Nanniperi, P.: Methods in Applied Soli Microbiology and Biochemistry, 1995


Letölteni ppt "Lipáz enzimaktivtás mérése. Lipidek Vegyületek heterogén csoportja Vízoldhatatlan Organizmusokban általában fehérjékkel (lipoproteinek), szénhidrátokkal."

Hasonló előadás


Google Hirdetések