Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Időfelbontásos lézerspektroszkópia Cél: fluoreszcencia (v. foszforeszcencia-élettartam meghatározása, Biológiában, anyagtudományban mikrokörnyezet vizsgálata.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Időfelbontásos lézerspektroszkópia Cél: fluoreszcencia (v. foszforeszcencia-élettartam meghatározása, Biológiában, anyagtudományban mikrokörnyezet vizsgálata."— Előadás másolata:

1 Időfelbontásos lézerspektroszkópia Cél: fluoreszcencia (v. foszforeszcencia-élettartam meghatározása, Biológiában, anyagtudományban mikrokörnyezet vizsgálata Ha több fluoreszkáló komponens van, ezek elválasztása

2 Ha egy fluoreszkáló anyagot besugározunk, bizonyos számú molekula gerjesztődik amikor a sugárzást megszüntetjük, a molekulák fokozatosan visszakerülnek az alapállapotba. Ált. 1. rendű kinetika: N(t): gerj. molekulák száma a besug. után t idővel k R : sugárzásos átmenet seb. állandója k NR : sugárzásmentes átmenet seb. állandója

3 Integrálva: Exponenciális lecsengés A fluoreszcencia-intenzitás arányos N-nel.

4 t  I 0 /e I0I0 I gerj. imp. Fluoreszcencia-intenzitás az idő függvényében a) Az impulzus rövid a lecseng. időáll.-hoz képest

5 t lnI  tg  = -t/ 

6 Elvileg egyszerű, de a jel-zaj viszony szempontjából kedvezőtlen! (l. nemsokára)

7 b) Az impulzus hossza összemérhető a lecseng. időáll.-val Négyszög-impulzus (folyt. lézerből fényszaggatóval) lézer-intenzitás N(t)

8 10.1. Viszonylag hosszú időállandók (ms) meghatáro-zása - foszforeszcencia - ritka földfémek emissziója I: Folytonos lézer + fényszaggató + boxcar vagy elektrooptikai modulátor vagy akusztooptikai modulátor II: Lézeres villanófényfotolízis

9 Megvalósítás I: boxcar-os rendszerrel folytonos lézer monokro- mátor PMT boxcar regiszt- ráló minta fényszag- gató

10 lézer-intenzitás N(t) Miért kedvezőtlen a nagyon rövid gerj. impulzus? Kevés molekula gerjesztődik!

11 10. Villanófény-fotolízis

12 Villanófény-fotolízis

13 Foszfolipid vezikula kettősrétegében oldott porfirin triplett lecsengése oxigén jelenlétében.

14 Foszfolipid: sejtmembránokban található anyagok, hidrofil „fejjel” és lipofil „farokkal”

15 Egy foszfolipid vezikula (idealizált) szerkezete, feltüntetve az apoláros próbamolekula legvalószínűbb helyét.

16 Triplett antracén abszorpciós spektruma A: hexánban, B: DMPC vezikulában 25 o C-on, C: DMPC vezikulában 18 o C-on.

17 Szingulett oxigénnel reagáló akceptor fogyása az akceptor abszorbanciájának mérésével.

18 A szingulett oxigén IR emissziós jele hematoporfirin szenzibilizátor jelenlétében. A megvastagított vonal extrapoláció.

19 11.1. Időkorrelált egyfoton-számlálás: egy fényimpulzus gerjeszti a mintát, és a fluoreszcencia lecsengését vizsgáljuk az időben Fázismodulációs módszer: szinuszos intenzitás modulációt alkalmazunk, és a szintén szinuszos intenzitás eloszlású fluoreszcencia fázis- eltolódását vizsgáljuk. (Pumpa módszerek: külön tárgyaljuk Tulajdonképpen az impulzusos módszerhez tartozik.)I 11. Időfelbontásos fluoreszcencia- spektroszkópiai módszerek

20 idő-ampl. átalakító analóg-digitál átalakító számítógép impulzuslézer minta monokromátor trigger PMT START STOP 11.1.Időkorrelált egyfotonszámlálás Mérőrendszer

21 A fényforrás impulzuslézer START jel – lézernek és elektronikának Triggerrel vagy: Az impulzus egy részét fényosztóval kicsatoljuk. Fotodetektorra kerül, ez adja az elektronika indítóimpulzusát (A lézerimpulzus másik része a mintára kerül) Az indítóimpulzus az idő-amplitúdó átalakítón elindít egy feszültség-növekedést.

22 U t STOP START Idő-amplitúdó átalakító

23 A mintából eredő lumineszcencia PMT-re kerül Úgy állítjuk be a gerj. fény intenzitását, hogy egyetlen foton váltson ki áramot a fotokatódon. Amikor a PMT-ből származó impulzus eléri az idő-amplitúdó átalakítót, megáll U növekedése. A kialakult jel arányos az eltelt idővel (a fluoreszc. időkésésével). Sok ezer, vagy 10ezer fényimpulzus után mérjük az első foton érkezési idejét Többcsatornás analizátorral dolgozzuk fel.

24 gyakoriság csatornaszám (idő)

25 A fluoreszc. élettartama ált. összemérhető a lézerimp. hosszával  Dekonvolúció E(t): a lézerimp. és a készülék együttes profilja F(t): a fl. lecsengése L(t): a mért görbe (az előző kettő konvolúciója)

26 I(t) t E(t) L(t)

27 Níluskék festék fluoreszcencia-lecsengése toluolban

28 11.2. Fázismodulációs módszer Folytonos lézer amplitúdóját szinuszosan moduláljuk.  fluoreszcencia Int. t

29 Folytonos lézer ModulátorMinta Monokromátor PMT Lock-in ( fázisérzékeny detektor) Referencia jel szűrő Fázismodulációs mérőrendszer

30 Két mérési eredményből is számítható Fázisszögből: Demodulációból:

31 Elsősorban impulzuslézerrel. A mintára intenzív impulzust bocsátunk (pumpaimp.). Molekulák egy része gerj. állapotba kerül. A később érkező próbaimpulzus „észleli” a változást. Időkésleltetés: optikai úthossz megnövelésével. A fény 1 ns alatt 30 cm-t 1 ps alatt 0,3 mm-t tesz meg. 12. Pumpa-próba elvű módszerek

32 Pumpa-próba mérés I: tranziens abszorpció mérése egy lézerrel

33 tt Próbanyaláb intenzitása

34 Pumpa-próba kísérlet II: Tranziens abszorpció két lézerrel

35 Níluskék metanolos oldatának tranziens abszorpciója pumpa-próba módszerrel mérve ( pumpa = 586 nm)

36 Níluskék tranziens absz. lecsengése vizes oldatban pumpa- próba módszerrel mérve ( pumpa = 586 nm, próba = 647 nm)

37 Pumpa-próba Módszer III: tranziens emisszió mérésére: „Fluorescence up-conversion” Femtoszekundumos folyamatok vizsgálatára használható

38 Ti-zafír lézer BBO dikroikus tükör minta saroktükör BBO szűrő mono- kromátor PMT   22 FF +F+F

39 DCM lézerfesték fluoreszcencia-lecsengése etilénglikolban P. van der Meulen, J.Phys. Chem. 100, 5367 (1996) Magyarázat: a kisebb hullámhosszakon gerjeszthető S 2, S 3 állapotokból töltődik fel az S 1

40 Lézer-Raman spektroszkópia A Raman-effektus már a lézerek felfedezése előtt ismert volt Brillouin Fény és hanghullámok kölcsönhatása 1923 Smekal Raman-szórás elmélete 1928 Raman Kísérleti igazolás

41 13.1. Hagyományos Raman-spektroszkópia Rezonancia-Raman effektus Felületerősített Raman-szórás Hiper Raman-effektus Stimulált Raman-effektus Raman erősítési spektroszkópia Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia Spektrumok TARTALOM

42 A Raman-spektrum az IR és mikrohull. spektrum kiegészítője. Főleg rezgési és forgási spektrumok mérésére 13.1 Hagyományos Raman-spektroszkópia

43 A lézerek előtt a R-spektroszkópia fejlődését gátolta, hogy nem volt intenzív monokromatikus fényforrás. Főleg higanygőzlámpát használtak (a 254 nm-es vonalát). A lézerek leterjedése - minőségi ugrás

44 R-szórás: a foton rugalmatlan ütközése a molekulával. s b a L s b a L StokesAnti-Stokes

45 Készülék: - Diszperziós: hasonló a spektrofluoriméterhez. Monokromátor: két rács (nagyobb felbontás kell) - Fourier-transzformációs Raman: monokromátor helyett interferométer

46 Diszperziós Raman-spektrométer

47 Nd-YAG lézer mozgó tükör álló tükör minta detektor fényosztó FT-Raman spektrométer szűrők

48 Antracén Raman-színképe (A) Diszperziós Raman-készülék, exc =514,5 nm (B) FT-Raman készülék, exc =1064 nm Chase, J. Am. Chem. Soc. 108, 7486 (1986)

49 Raman és infra összehasonlítása Raman előnyei Vizes oldatok Optika üvegből Kisebb minta (fókuszálás) Detektor gyorsabb Raman-spektrum egyszerűbb Szimm. rezgések R-aktívak Polarizációs mérések Intenzitás arányos konc.-val Kis hullámszámok tartománya is mérhető Raman hátrányai Drágább R-spektrum készülékfüggőbb Infra érzékenyebb Fluoreszcencia zavaró hatása

50 Raman-mikroszkóp Búzaszem

51

52 13.2. Rezonancia-Raman effektus Ha a Raman-átmenet felső szintje nem virtuális, hanem valóságos, akkor a Raman-intenzitás megnő. Speciális Raman-módszerek Ha a minta fluoreszkál, nehéz detektálni a Raman- jelet.

53 Emberi vér rezonancia Raman-színképe az O 2 telítettség függvényében artériás vér: a) hemoglobin O2 telítettség 99 %, vénás vér: b) 78 %, c) 68 %, d) 26 % K. R. Ward, Anal. Chem. 79, 1514 (2007)

54 13.3. Felületerősített Raman-szórás (Surface Enhanced Raman Scattering - SERS) Érdes felületen adszorbeált molekulák Raman- intenzitása nagyságrendekkel nőhet.. Először Ag felületén adszorbeált piridinen észlelték 1974-ben. 6 nagyságrend érz. növekedés is elérhető. Akkor lép fel, ha a mintára lépő foton energiája megegyezik egy, a fémben lévő vezetési elektronenergia-átmenetével.

55 Furfural adszorpciója kolloid ezüstön Raman-színkép (a) oldatban, (b) kolloid ezüstön T.-J. Jia, J. Mol. Struct. (2007)

56 14.1. Hiper Raman-effektus: két foton egyidejű rugalmatlan ütközése b a L L b a AS L L Stokesanti-Stokes  E = 2h L -h S

57 Frekvencia-kettőzés : hiper-Rayleigh szórás A hiper Raman-effektus nehezen észlelhető - nagy lézer-intenzitás kell. Mások a kivál. szabályok, mint a normál Ramanban. Olyan átmenetek is tanulmányozhatók, amelyek infra- és Raman-inaktívak.

58 14.2. Stimulált Raman-effektus virtuális E szint h L h S a b 2h S

59 Véletlenül fedezték fel. Woodbury és Ng Rubinlézer Q-kapcsolását tanulmányozták. Nitrobenzolt tart. cella Kevesebb piros (694,3 nm) fény jött ki, mint várták. 766 nm-es koherens fényt találtak. A különbség megfelel a nitrobenzol 1350 cm -1 rezg. frekv.-jának.

60 Magyarázat: a kezdetben spontán Raman- emisszióval keletkező Stokes-fotonok a sugárzás irányában újabb Stokes-fotonokat váltanak ki. h L h S

61 A Stimulált Raman-effektuson alapul több nem- lineáris Raman-spektroszkópiai módszer. Önmagában nem terjedt el. Csak a legerősebb Raman-átmenetek figyelhetők meg - versengés.

62 oszcillátor L L S generátor S tükör "Raman lézer" S S L L er ősítő modell L gyengül, S erősödik Kísérleti megvalósítások Erősítő: nincs küszöb, a teljes spektrumot mérhetjük

63 14.3. Raman erősítési spektroszkópia „Stimulated Raman gain”: S -t mérjük Inverz Raman: L -t mérjük lézer S S L L detektor Dikroikus tükör minta

64 Előny: nem kell monokromátor (az egyik lézert hangoljuk). Felbontást a lézerek sávszélessége határozza meg. Inverz Raman: a nagyobb frekv. fényt detektáljuk - fluoreszcencia zavarásának kiküszöbölése Felhasználás: nagyfelbontású Raman spektroszkópia

65 5-CB folyadékkristály inverz Raman-színképe

66 Az 5-CB 1606 cm—es inverz Raman jelének intenzitása négyszögfeszültséget kapcsolva a mintára

67 14.4. Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia „Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy” CARS Négy foton vesz részt a folyamatban Kettőt elnyel, kettőt kibocsát a molekula Visszajut a kiind. energiaállapotba.

68 CARS alapkísérlet Imp.lézer L L L, S AS folyadék

69 Nómenklatúra: L  1 AS  3 S  2

70 L AS L Termdiagram Energia-megmaradás: 2 1 = S a b

71 Indexillesztés: Kondenzált fázisban a törésmutatók különböznek (  függvényében) Ha kollineáris sugarakat használunk, a jel nagyon gyenge. Impulzus-megmaradás törvényének is teljesülnie kell. Hullámvektor: Hullámszám az anyagban

72 Folyadék- fázisban Gázfázisban

73 A lézersugarakat a mintára fókuszáljuk

74 Berendezés vázlata

75 Spontán Raman és CARS összehasonlítása Spontán RamanCARS foton kell egy szórt foton előállításához foton elég Inkoherens, csak egy részét gyűjtjük össze Koherens, 90 %-os hatás- fokkal összegyűjthető Felbontást a mono- kromátor limitálja Jel ~ I 1 2 ·I 2 ·c 2 Jel ~ I L ·c Felbontást a lézerek sáv- szélessége limitálja

76 Spektrumok A kloroform Raman(a) és IR (b) spektruma

77 C 60 FT-Raman spektruma

78 Kétatomos molekula rotációs energianívói: A spektroszkópiában gyakran cm -1 -ben fejezik ki az energia-külöbségeket: Itt a fénysebességet cm/s-ban kell behelyettesíteni. B: rotációs konstans

79 J  J B 2 6B 312B 420B Kiválasztási szabályok:  J = 0,  2

80 Kétatomos molekula rotációs energia-nívói és a Raman-átmenetek

81 Kétatomos molekula Raman-spektruma

82 O 2 tiszta rotációs inverz Raman- spektruma

83 O 2 rezgési-forgási Q- ágának nagyfelbontású Raman-erősítési spektruma

84 SF 6 rezgési-forgási Q-ágának nagyfelbontású Raman- erősítési spektruma


Letölteni ppt "Időfelbontásos lézerspektroszkópia Cél: fluoreszcencia (v. foszforeszcencia-élettartam meghatározása, Biológiában, anyagtudományban mikrokörnyezet vizsgálata."

Hasonló előadás


Google Hirdetések