Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

1 ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] PÁLLINGER ÉVA Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "1 ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] PÁLLINGER ÉVA Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas."— Előadás másolata:

1 1 ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] PÁLLINGER ÉVA Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas laboratóriumi eljárás Az áramlási citometria és citométer működésének elve. A minta preparálása. A sejtpopuláció azonosítása méret és granuláltság szerint, scatter plot. Immunfenotipizálás, fluoreszcens jelölés, hisztogram, dot plot. Sejtfelszíni és sejten belüli antigének kimutatása. További alkalmazási területek: sorting, sejtciklus-analízis. Klinikai alkalmazási területek (példákkal): diagnózis, terápia és betegség progresszió monitorozása, prognózis. Gyakorló feladatok.

2 2 A FLOW CYTOMETRIA ELŐNYEI FLOW CYTOMETRIA SEJT / VIZSGÁLAT 1-2 MIN/ VIZSGÁLAT OBJEKTÍV (+/-) JÓ REPRODUKÁLHATÓSÁG AUTOMATIZÁLT MINTA ELŐKÉSZÍTÉS MIKROSZKÓPIA SEJT / VIZSGÁLAT 4-5 MIN/ VIZSGÁLAT SZUBJEKTÍV (+/-) GYENGÉBB REPRODUKÁLHATÓSÁG IDŐIGÉNYESEBB MINTAELŐKÉSZÍTÉS

3 3 Mit mond el az áramlási citometria a sejtekről? A relatív sejtméretet (Forward Scatter—FSC) A sejtek relatív granuláltságát ill. belső komplexitását (Side Scatter—SSC) A fluoreszcencia intenzitásukat

4 4 Hogyan működik az áramlási citométer? Folyadék rendszer: Biztosítja a sejtek áramlását, a sejteket a gerjesztés helyére fókuszálja Optikai rendszer: 1) fénygerjesztés: laser 2) az emittált fény eljuttatása a fotonsokszorozóhoz (PMT) Elektronikus rendszer: a fényjelek digitális jellé alakítása

5 5 Folyadék rendszer Minta felvételi pont sheath flow (burok folyadék ) laser sugár Hidrodinamikus fókuszálás Minta áramlás Flow cell (áramlási cella)

6 6 Optikai rendszer A dikroikus filterek szelektíven engedik át a fényt. A fénysugár irányításában és a PMT-be jutó fény „kiválasztásában” van szerepük.

7 7 BD Facs Calibur

8 8 Milyen kérdéseket tehetünk fel egy áramlási citométernek? 1.Azonosíthatók a sejtpopulációk a vizsgálati mintában? (heterogenitás) 2.Meghatározható a sejtek aktiváltsági, differenciáltsági és érési stádiuma? 3.Jellemezhetjük a sejtek funkcionális állapotát? 4.Meghatározhatjuk a sejtek abszolút számát a mintában? 5.Detektálhatjuk quantitatív módon különféle szolubilis fehérjék jelenlétét a mintában? 6.Fizikailag elválaszthatjuk (szeparálhatjuk) a sejteket egymástól? Válasz: IGEN

9 9 Milyen paramétereket használhatunk a kérdéseink megválaszolására? Relatív méret és granuláltság (FSC/SSC) Fluoreszcens jelek a sejtfelszínről és/vagy a citoplazmából Fluoreszcens jelek időbeni detektálása

10 10 MEGFIGYELÉSI MÓDOK 1.FESTETLEN VIZSGÁLATI MINTÁK ANALÍZISE (sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint) 2.FESTÉS FLUROKRÓMMAL JELZETT MONOKLONÁLIS ANTITESTEKKEL = IMMUNFENOTIPIZÁLÁS ( sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján ) 3.SEJTALKOTÓRÉSZEKHEZ SPECIFIKUSAN KÖTŐDŐ FESTÉKEK ALKALMAZÁSA Sejtszuszpenzió!!!

11 11 Mintaelőkészítés Sejtszuszpenzió készítés Alvadt vérből (alvadékos vérből) nem lehet mérést végezni! Erythrolysis Festés (ha szükséges) Sejtalkotórészek közvetlen jelölése Immunfenotipizálás

12 12 Minőség ellenőrzés Technikai A készülék beállításának és állapotának ellenőrzése (napi és időszakos) Fluoreszcencia kompenzáció Biológiai A mintaelőkészítés ellenőrzése (pozitív és negatív kontrollok használata) Izotípus ellenanyag jelölés Autofluoreszcencia detektálás

13 13 Fényszórási jellegzetességek Right Angle Light Detector (Side scatter parameter = SS) Granuláltság Forward Light Detector (Forward scatter parameter == FS) Sejtméret Light Source (LASER)

14 14 Sejtmegoszlás méret és struktúráltság szerint Lymphocyta Basophil granulocyta Monocyta Neutrophil granulocyta Eosinophil granulocyta méret granuláltság

15 15 Sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint egészséges csontvelőMilyen eltérést lát a képen, mi okozhatja?

16 16 Mi is az a fluoreszcencia? A fluorochrom energiát vesz fel a laser fényből (gerjesztődés) A fluorochromok kibocsájtják a felvett energiát: A kibocsátott fény hullámhossza nagyobb, mint a gerjesztő fényé = 488 nm = 488 nm kibocsátott f luorescens fény Antitest Fényenergia Fluorescens Molecula = 520 nm HO CO 2 H O C

17 17 Emissziós spektrum A kibocsátott fény hullámhossza függ: 1) a fluorokróm típusától, 2) a fluorokróm környezetétől APC PerCP Wavelength (nm) % 0% Normalized Intensity FITC RPE 800 peridinin chlorophyll A protein Fluorescein isothiocyanate R-Phycoerythrin Allophycocyanin

18 18 Fluoreszcencia Az emittált fluoreszcencia intenzitás arányos a gerjesztett festék molekulák számával FITC Fluoreszcencia intenzitás (log) Sejtszám

19 19 A fluoreszcens jelek grafikus megjelenítése HisztogramFelhő kép (Dot plot)

20 20 SEJTTÍPUSOK Cluster of Differentiation = CD (Differenciálódási markerek) 1. Leukocyta szubpopulációk azonosítása 2. Leukocyták érési / funkcionális állapotának meghatározása „Az immunológia alapjai” TK Függelék 1. táblázat

21 21 Differenciálódási markerek FELHASZNÁLÁSA AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK VIZSGÁLATÁBAN: IMMUNFENOTIPIZÁLÁS MÓDSZEREK: ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNHISZTOKÉMIA

22 22 Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján IMMUNFENOTIPIZÁLÁS Expresszió: IGEN (+) vagy NEM (-) A „pozitív” és a „negatív” populációk %-os megoszlása A sejtek relatív fehérje expressziója Koexpresszió Megválaszolható (biológiai) kérdések:

23 23 Lymphocyta alcsoportok Funkcionális és morfológiai (immunfenotípus) kategóriák CD3- CD56+ CD3+ CD56+ CD19+ CD3+  TCR+ CD4- CD8- CD3+ CD8+ CD3+ CD4+ CD3+ IFNg+ IL-12+ TNF  IL4+ IL-5+ IL-10+ IL-13+ IL-17+ TGF  + Ly T B NK TcTh Th17 Th2 Th1  T NKT Plazmasejt ic könnyűlánc+ B1 B2 CD5+ CD4+ CD25 high + Foxp3+ Treg

24 24 „Igen-nem” válasz 1.Jelen van-e a vizsgálati mintában a keresett sejttípus? 2.Mekkora arányban van jelen? 3.Mekkora az abszolút mennyisége?

25 25 Sejtfelszíni antigén expresszió mértéke CD4 high+ CD4 dim+ Azonos mértékben expresszálják-e a vizsgálati minta sejtjei a keresett fehérjét? Mire lehet következtetni az expressziós eltérésekből? lymphocyta monocyta

26 26 IMMUNFENOTIPIZÁLÁS CD3+/CD8+ CD3+/CD8- CD3-/CD8+ CD3-/CD8- Milyen sejttípusba tartozhatnak a kettős negatívan festődő sejtek?

27 27 KLINIKAI PÉLDA AZ IMMUNFENOTIPIZÁLÁSRA

28 28 Myeloma multiplex: a plazmasejtek daganatos megbetegedése Eset leírás: 36 éves férfi minimális traumát követően felkar törést szenvedett. Gyakran fáj a háta, időnként lázas is. Testsúly mérsékelten csökkent az utóbbi időben, változatlan táplálkozási szokások mellett. Fizikális vizsgálat: a láz és a hátfájdalom eredetére utaló jel nem észlelhető. RTG vizsgálat: diffúz osteoporosis a gerinc háti szakaszán Laboratóriumi vizsgálatok: anaemia, hypercalcemia, monoklonális paraprotein.  Iránydiagnózis: Myeloma multiplex  Javasolt a csontvelő vizsgálata: kenet, FACS csontvelő

29 29 B SEJTVONAL DIFFERENCIÁLÓDÁSI ANTIGÉNEK Pro B Pre B Éretlen B Érett B Aktivált B Plazmasejt lymphoid progenitor CD34+ CD19+ CD10+/- ic CD22+ HLA-DR+ TdT+ CD34+/- CD19+ CD20+ CD10+ ic CD22+ ic  + HLA-DR+ TdT+ CD19+ CD20+ CD21+ CD22+ sIgM+ CD34- CD10- HLA-DR+ TdT+ CD19+ CD20+ CD21+ CD22+ sIgM+/sIgD+ HLA-DR+ FcR+ CD11b+ CD19+ CD20+ CD21+ CD22+ sIg+ HLA-DR+ FcR+ CD11b+ CD19- CD45- CD38+ sIg- ic  + v. ic + HLA-DR+ CD34+ ckit (CD117) + HLA-DR+ TdT+ csontvelő antigén-független periféria antigén-függő

30 30 A Myeloma multiplex diagnosztikája FACS módszerrel CD45/CD14 CD45/CD38/HLA-DR CD45/CD138 CD10/CD5/CD19 CD34/CD33/CD19 CD22/CD20 Kappa/Lambda/CD19 intracelluláris kappa/lambda CD4/CD8/CD3 KONSZENZUS PROTOKOLL

31 31 Csontvelő (FACS) Nagy méretű sejtek CD45 negatív CD38 pozitív CD45/CD38 jelölés

32 32 Nagy méretű sejtek CD45 negatívCD138 pozitív CD45/CD138 jelölés

33 33 Sejtfelszíni  / /CD19 jelölés

34 34 Citoplazmatikus  / jelölés Nagy méretű sejtek Citoplazmában sok Immunfenotípus: CD45-/CD19-/CD38+/CD138+/iclambda+: plazmasejt

35 35 CD4+/CD25+ CD4+/CD25high+ Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásával KLINIKAI PÉLDA AKTIVÁLT Th SEJTEKREGULATÓRIKUS T SEJTEK

36 36 A sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásának klinikai jelentősége Izotípus kontroll 1. vérvétel 2. vérvétel 1. vérvétel 2. vérvétel A monociták HLA-DR expressziójának csökkenése rossz prognózist jelent szeptikus állapotokban.

37 37 Kalibrációs görbe Technikai vonatkozások * M1 y = 1,0076x – 1,6642 r 2 = 0,999

38 38 Immunfenotipizált sejtek további vizsgálati lehetőségei: sejtszeparálás („sorting”)

39 39 „WASTE” MINTA ÁRAMLÁSI CELLA „WASTE” ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK MINTA Mechanikus szortolás

40 40 ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK 1 MINTA „WASTE” SZEPARÁLT SEJTEK 2 KONDENZÁTOR ELEKTROMOS TÖLTÉS Elektrosztatikus szortolás

41 41 RNS izolálás HDC expresszió Csontvelő CD34+ sejtek Sejtpopulációk jellemzése sejtszeparálás után KUTATÁSI PÉLDA

42 42 Sejtalkotórészekhez specifikusan kötődő festékek alkalmazása

43 43 SEJTCIKLUS ANALÍZIS: PI festés Propidium jodid (PI) a kétszálú DNS-hez és RNS-hez sztöchiometrikusan kötődő fluorokróm. Alkalmazásával lehetőség nyílik a nekrotikus, az apoptotikus és az ép sejtek elkülönítésére. Klinikai jelentőség: malignus sejtek osztódási képességének jellemzése „S” fázis emelkedés malignus sejtekben

44 44 A flow cytometria klinikai alkalmazása

45 45 Klinikai megközelítés Diagnózis Terápia monitorozás Prognózis Pathológiás állapotok aktivitásának nyomonkövetése

46 46 Rutin vizsgálatok célja Sejtarányok és abszolút sejtszámok meghatározása Pathológiás sejtek kvalitatív és kvantitatív analízise Aktivációs markerek kimutatása Sejtciklus vizsgálatok Sejtek funkcionális jellemzése

47 47 A flow cytometria helye a rutin klinikai gyakorlatban HEMATOLÓGIAI KÓRKÉPEK IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK Autoimmun betegségek HLA-asszociált betegségek Fertőzések

48 48 A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN

49 49 A malignus haematológiai betegségek diagnosztikája Klinikai tünetek Morfológia Quantitativ és qualitativ vérkép Csontvelő kenet ill. biopszia Cytokémia Flow cytometria, immunhisztokémia Cytogenetika, molekuláris genetika

50 50 A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN DIAGNÓZIS / DIFFERENCIÁL DG. MARADÉK LEUKAEMIA (minimal residual disease) BETEGSÉG KIÚJULÁS (recidiva) CHEMOTHERÁPIA MONITOROZÁS MULTIDRUG REZISZTENCIA

51 51 AKUT LEUKÉMIA AML, AMML ALL nonT-ALLT-ALL CALLA+ CALLA- DIAGNOSZTIKUS SÉMA A LEUKÉMIÁK VISGÁLATÁHOZ CALLA = common acute lymphoid leukemia antigen = CD10 A legfontosabb prognosztikus marker az ALL diagnosztikájában

52 52 MULTIDRUG REZISZTENCIA MDR fehérje vizsgálata FACS módszerrel Pgp kimutatás (immunfenotipizálás) Pgp funkcionális jellemzés (pl. Calcein)

53 53 FL Aktív pumpa funkció Fluorokrómmal feltöltött sejt FL sejtszám FL sejtszám

54 54 IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK CONGENITÁLIS (PRIMER) ŐSSEJT DEFEKTUSOK A TERMÉSZETES IMMUNRENDSZER MŰKÖDÉSI ZAVARAI A HUMORÁLIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI A CELLULÁRIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI SZERZETT (SZEKUNDER) pl. HIV fertőzés

55 55 NORMÁL SEJTARÁNYOK VÁLTOZÁSÁNAK DETEKTÁLÁSA IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOKBAN lymphocyta szubpopulációk vizsgálata: CD45/CD14 (quality control: ly kapu tisztasága) CD3/CD19 (T / B arány) CD3/CD56 (T / NK arány) CD8/CD4/CD3 (Tc / Th arány) CD5/CD19 (B1 B, össz B) CD4/CD3/CD45RO (Memória T)sIgM/sIgD/CD19 (naiv B) CD4/CD3/CD45RA (Naiv T) CD4/CD8/CD25 (aktivált T, ill. Treg)  /CD19 (B sejt klonalitás) TCR 

56 56 VIZSGÁLATOK AIDS-BEN CD3+/CD4+ Th SEJTEK QUANTITATÍV MEGHATÁROZÁSA  PROGNÓZIS IMMUNSTÁTUSZ MONITOROZÁS

57 57 A flow cytometria helye az autoimmun betegségek diagnosztikájában Nem diagnosztikus értékű Jó prognosztikus paraméterek A betegség aktivitásának nyomonkövetése

58 58 HLA-ASSZOCIÁLT BETEGSÉGEK Diagnózis alátámasztása Prognosztikus jelentőség Kockázati tényező Leggyakoribb klinikai alkalmazás HLA-B27 expresszió vizsgálata perifériás leukocitákon (Bechterew)

59 59 A FLOW CYTOMETRIA HELYE A FERTŐZÉSES ÁLLAPOTOKBAN Az immunrendszer válaszkészségének monitorozása VÍRUS FERTŐZÉSEK: CD4/CD8 ARÁNY CSÖKKEN BAKTERIÁLIS FERTŐZÉSEK : ABSZOLÚT CD4+ és CD8+ T SEJT SZÁM CSÖKKENÉS SZEPSZIS CD14 DIM /CD16 HIGH /HLA-DR+/CD4+/CR1+ MONOCYTA SZUBPOPULÁCIÓ NŐ CD14+/HLA-DR+ MONOCYTA CSÖKKEN T SEJT AKTIVÁCIÓ NYOMONKÖVETÉSE T SEJT APOPTÓZIS MEGHATÁROZÁSA

60 60 FUNKCIONÁLIS TESZTEK

61 61 Sejtfunkciók vizsgálata autoimmun betegségekben A BETEGSÉG AKTIVITÁSÁNAK NYOMONKÖVETÉSE 1.Th1/Th2 sejtarány kimutatása az intracelluláris citokinek detektálásával 2.Szolubilis citokinek kimutatása testnedvekben (mikrogyöngy módszer)

62 62 Intracelluláris citokin kimutatás Milyen sejtpopulációk láthatók az ábrák bal felső részén?

63 63 Y Y * * Y Y Y * * Y Y Y * * Y mikrogyöngy Y Citokint felismerő ellenanyag 1. * Y Fluorokrómmal jelzett citokint felismerő ellenanyag 2. Citokin Szolubilis citokin kimutatás Melyik korábban tanult módszerhez hasonlít?

64 64 Sejtfunkciók vizsgálata immunhiányos állapotokban FAGOCITA KÉPESSÉG VIZSGÁLATA (FLUOROCHROMMAL JELZETT PARTIKULUMOK FELVÉTELE) ROI TERMELÉS VIZSGÁLATA

65 65 Fagocita képesség vizsgálata

66 66 ÖSSZEFOGLALÁS

67 67 A FLOW CYTOMETRIA ABSZOLÚT INDIKÁCIÓS TERÜLETEI Malignus hematológiai betegségek diagnosztikája és differenciáldiagnosztikája Minimális reziduális betegség kimutatása Multidrug rezisztencia vizsgálata Csontvelő transzplantáció nyomonkövetése AIDS

68 68 A FLOW CYTOMETRIA RELATÍV INDIKÁCIÓS TERÜLETEI Autoimmun betegségek aktivitásának nyomonkövetése HLA-asszociáció kimutatása Fertőzések nyomonkövetése Sejtciklus analízis Sejtfunkciók detektálása Receptro expresszió kimutatás

69 69 Irodalom: Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 5. fejezet. Falus A, Buzás E., Rajnavölgyi É. (Szerk.): Az immunológia alapjai, fejezet Következő hétre: Immunszerológia Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 3. fejezet.

70 70 Fakultaív gyakorlás Milyen sejtek szaporodtak fel a vizsgálati mintában? Mi a diagnózis?

71 71 PRE-PRO B SEJTEK: CD34+/CD10+/CD19+ 1.

72 72 1.Homogén ly- blaszt populáció 2.Granulocyta kevés 3.CD45dim+/HL A-DR+ 2.

73 73 CD34+/CD33+ 2.

74 74 CD7+/CD13+ CD45dim+/HLA-DR+/ CD34+/CD33+/CD7+  AML 2.

75 Ly populáció  2.Sok HLA-DR+ ly

76 76 3. Ly kapun belül sok CD19+/CD5+ B1 B sejt

77 77 3. A CD19+ B sejtek lambda könnyűláncot expresszálnak (klonális felszaporodás)

78 78 CD45+/CD19+/CD5+/sejtfelszíni lambda+/HLA-DR+  B-CLL 3.

79 79 Animált tutorial ation/tutorials/4Intro_Flow/player.htmlhttp://probes.invitrogen.com/resources/educ ation/tutorials/4Intro_Flow/player.html


Letölteni ppt "1 ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] PÁLLINGER ÉVA Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas."

Hasonló előadás


Google Hirdetések