Időfelbontásos lézerspektroszkópia

Az előadások a következő témára: "Időfelbontásos lézerspektroszkópia"— Előadás másolata:

1 Időfelbontásos lézerspektroszkópia
Cél: fluoreszcencia (v. foszforeszcencia-élettartam meghatározása, Biológiában, anyagtudományban mikrokörnyezet vizsgálata Ha több fluoreszkáló komponens van, ezek elválasztása

2 Ha egy fluoreszkáló anyagot besugározunk, bizonyos számú molekula gerjesztődik
amikor a sugárzást megszüntetjük, a molekulák fokozatosan visszakerülnek az alapállapotba. Ált. 1. rendű kinetika: N(t): gerj. molekulák száma a besug. után t idővel kR: sugárzásos átmenet seb. állandója kNR: sugárzásmentes átmenet seb. állandója

3 Integrálva: Exponenciális lecsengés A fluoreszcencia-intenzitás arányos N-nel.

4 Fluoreszcencia-intenzitás az idő függvényében a) Az impulzus rövid a lecseng. időáll.-hoz képest
I0/e I0 I gerj. imp.

5 t lnI a tga = -t/t

6 Elvileg egyszerű, de a jel-zaj viszony szempontjából kedvezőtlen! (l. nemsokára)

7 b) Az impulzus hossza összemérhető a lecseng. időáll.-val
Négyszög-impulzus (folyt. lézerből fényszaggatóval) lézer-intenzitás N(t)

8 10.1. Viszonylag hosszú időállandók (ms) meghatáro-zása - foszforeszcencia - ritka földfémek emissziója I: Folytonos lézer + fényszaggató + boxcar vagy elektrooptikai modulátor vagy akusztooptikai modulátor II: Lézeres villanófényfotolízis

9 Megvalósítás I: boxcar-os rendszerrel
folytonos lézer monokro- mátor PMT boxcar regiszt- ráló minta fényszag- gató

10 Miért kedvezőtlen a nagyon rövid gerj. impulzus?
Kevés molekula gerjesztődik! lézer-intenzitás N(t)

11 10. Villanófény-fotolízis

12 Villanófény-fotolízis

13 Foszfolipid vezikula kettősrétegében oldott porfirin triplett
lecsengése oxigén jelenlétében.

14 Foszfolipid: sejtmembránokban található anyagok,
hidrofil „fejjel” és lipofil „farokkal”

15 Egy foszfolipid vezikula (idealizált) szerkezete, feltüntetve az
apoláros próbamolekula legvalószínűbb helyét.

16 Triplett antracén abszorpciós spektruma A: hexánban,
B: DMPC vezikulában 25oC-on, C: DMPC vezikulában 18oC-on.

17 Szingulett oxigénnel reagáló akceptor fogyása az akceptor
abszorbanciájának mérésével.

18 A szingulett oxigén IR emissziós jele hematoporfirin
szenzibilizátor jelenlétében. A megvastagított vonal extrapoláció.

19 11. Időfelbontásos fluoreszcencia- spektroszkópiai módszerek
11.1. Időkorrelált egyfoton-számlálás: egy fényimpulzus gerjeszti a mintát, és a fluoreszcencia lecsengését vizsgáljuk az időben. 11.2. Fázismodulációs módszer: szinuszos intenzitás modulációt alkalmazunk, és a szintén szinuszos intenzitás eloszlású fluoreszcencia fázis-eltolódását vizsgáljuk. (Pumpa módszerek: külön tárgyaljuk Tulajdonképpen az impulzusos módszerhez tartozik.)I

20 11.1.Időkorrelált egyfotonszámlálás Mérőrendszer
minta impulzuslézer monokromátor trigger START analóg-digitál átalakító számítógép idő-ampl. átalakító PMT STOP

21 A fényforrás impulzuslézer
START jel – lézernek és elektronikának Triggerrel vagy: Az impulzus egy részét fényosztóval kicsatoljuk. Fotodetektorra kerül, ez adja az elektronika indítóimpulzusát (A lézerimpulzus másik része a mintára kerül) Az indítóimpulzus az idő-amplitúdó átalakítón elindít egy feszültség-növekedést.

22 Idő-amplitúdó átalakító
U t STOP START

23 A mintából eredő lumineszcencia PMT-re kerül
Úgy állítjuk be a gerj. fény intenzitását, hogy egyetlen foton váltson ki áramot a fotokatódon. Amikor a PMT-ből származó impulzus eléri az idő-amplitúdó átalakítót, megáll U növekedése. A kialakult jel arányos az eltelt idővel (a fluoreszc. időkésésével). Sok ezer, vagy 10ezer fényimpulzus után mérjük az első foton érkezési idejét Többcsatornás analizátorral dolgozzuk fel.

24 gyakoriság csatornaszám (idő)

25 A fluoreszc. élettartama ált. összemérhető a lézerimp
A fluoreszc. élettartama ált. összemérhető a lézerimp. hosszával  Dekonvolúció E(t): a lézerimp. és a készülék együttes profilja F(t): a fl. lecsengése L(t): a mért görbe (az előző kettő konvolúciója)

26 I(t) t E(t) L(t)

27 Níluskék festék fluoreszcencia-lecsengése toluolban

28 F 11.2. Fázismodulációs módszer
Folytonos lézer amplitúdóját szinuszosan moduláljuk. F Int. t fluoreszcencia

29 Fázismodulációs mérőrendszer
Folytonos lézer Modulátor Minta Monokromátor PMT Lock-in ( fázisérzékeny detektor) Referencia jel szűrő

30 Két mérési eredményből is számítható
Fázisszögből: Demodulációból:

31 12. Pumpa-próba elvű módszerek
Elsősorban impulzuslézerrel. A mintára intenzív impulzust bocsátunk (pumpaimp.). Molekulák egy része gerj. állapotba kerül. A később érkező próbaimpulzus „észleli” a változást. Időkésleltetés: optikai úthossz megnövelésével. A fény 1 ns alatt 30 cm-t ps alatt 0,3 mm-t tesz meg.

32 Pumpa-próba mérés I: tranziens abszorpció mérése egy lézerrel

33 Próbanyaláb intenzitása
Dt

34 Pumpa-próba kísérlet II:
Tranziens abszorpció két lézerrel

35 Níluskék metanolos oldatának tranziens abszorpciója pumpa-próba módszerrel mérve (lpumpa = 586 nm)

36 Níluskék tranziens absz
Níluskék tranziens absz. lecsengése vizes oldatban pumpa-próba módszerrel mérve (lpumpa = 586 nm, lpróba = 647 nm)

37 Pumpa-próba Módszer III: tranziens emisszió mérésére:
„Fluorescence up-conversion” Femtoszekundumos folyamatok vizsgálatára használható

38 dikroikus tükör BBO saroktükör   Ti-zafír lézer 2 minta szűrő mono-kromátor F BBO +F szűrő PMT

39 DCM lézerfesték fluoreszcencia-lecsengése etilénglikolban
Magyarázat: a kisebb hullámhosszakon gerjeszthető S2, S3 állapotokból töltődik fel az S1 P. van der Meulen, J.Phys. Chem. 100, 5367 (1996)

40 13-14. Lézer-Raman spektroszkópia
A Raman-effektus már a lézerek felfedezése előtt ismert volt. 1922 Brillouin Fény és hanghullámok kölcsönhatása 1923 Smekal Raman-szórás elmélete 1928 Raman Kísérleti igazolás

41 TARTALOM 13.1. Hagyományos Raman-spektroszkópia Rezonancia-Raman effektus Felületerősített Raman-szórás 14.1. Hiper Raman-effektus Stimulált Raman-effektus Raman erősítési spektroszkópia Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia Spektrumok

42 13.1 Hagyományos Raman-spektroszkópia
A Raman-spektrum az IR és mikrohull. spektrum kiegészítője. Főleg rezgési és forgási spektrumok mérésére

43 A lézerek előtt a R-spektroszkópia fejlődését gátolta, hogy nem volt intenzív monokromatikus fényforrás. Főleg higanygőzlámpát használtak (a 254 nm-es vonalát). A lézerek leterjedése - minőségi ugrás

44 R-szórás: a foton rugalmatlan ütközése a molekulával.
b a nL n s b a nL Stokes Anti-Stokes

45 Készülék: - Diszperziós: hasonló a spektrofluoriméterhez. Monokromátor: két rács (nagyobb felbontás kell) - Fourier-transzformációs Raman: monokromátor helyett interferométer

46 Diszperziós Raman-spektrométer

47 FT-Raman spektrométer
álló tükör minta Nd-YAG lézer mozgó tükör fényosztó szűrők detektor FT-Raman spektrométer

48 Antracén Raman-színképe
(A) Diszperziós Raman-készülék, exc=514,5 nm (B) FT-Raman készülék, exc=1064 nm Chase, J. Am. Chem. Soc. 108, 7486 (1986)

49 Raman és infra összehasonlítása
Raman előnyei Vizes oldatok Optika üvegből Kisebb minta (fókuszálás) Detektor gyorsabb Raman-spektrum egyszerűbb Szimm. rezgések R-aktívak Polarizációs mérések Intenzitás arányos konc.-val Kis hullámszámok tartománya is mérhető Raman hátrányai Drágább R-spektrum készülékfüggőbb Infra érzékenyebb Fluoreszcencia zavaró hatása

50 Raman-mikroszkóp Búzaszem

51

52 Speciális Raman-módszerek
13.2. Rezonancia-Raman effektus Ha a Raman-átmenet felső szintje nem virtuális, hanem valóságos, akkor a Raman-intenzitás megnő. Ha a minta fluoreszkál, nehéz detektálni a Raman-jelet.

53 Emberi vér rezonancia Raman-színképe az O2 telítettség függvényében
artériás vér: a) hemoglobin O2 telítettség 99 %, vénás vér: b) 78 %, c) 68 %, d) 26 % K. R. Ward, Anal. Chem. 79, 1514 (2007)

54 13.3. Felületerősített Raman-szórás
(Surface Enhanced Raman Scattering - SERS) Érdes felületen adszorbeált molekulák Raman-intenzitása nagyságrendekkel nőhet.. Először Ag felületén adszorbeált piridinen észlelték 1974-ben. 6 nagyságrend érz. növekedés is elérhető. Akkor lép fel, ha a mintára lépő foton energiája megegyezik egy, a fémben lévő vezetési elektronenergia-átmenetével.

55 Furfural adszorpciója kolloid ezüstön
Raman-színkép (a) oldatban, (b) kolloid ezüstön T.-J. Jia, J. Mol. Struct. (2007)

56 14.1. Hiper Raman-effektus: két foton egyidejű rugalmatlan ütközése
DE = 2hnL -hnS b a nAS nL b a nL Stokes anti-Stokes

57 Frekvencia-kettőzés : hiper-Rayleigh szórás
A hiper Raman-effektus nehezen észlelhető - nagy lézer-intenzitás kell. Mások a kivál. szabályok, mint a normál Ramanban. Olyan átmenetek is tanulmányozhatók, amelyek infra- és Raman-inaktívak.

58 14.2. Stimulált Raman-effektus
virtuális E szint hnL hnS a b 2hnS

59 Véletlenül fedezték fel
Véletlenül fedezték fel. Woodbury és Ng Rubinlézer Q-kapcsolását tanulmányozták. Nitrobenzolt tart. cella Kevesebb piros (694,3 nm) fény jött ki, mint várták. 766 nm-es koherens fényt találtak. A különbség megfelel a nitrobenzol 1350 cm-1 rezg. frekv.-jának.

60 Magyarázat: a kezdetben spontán Raman-emisszióval keletkező Stokes-fotonok a sugárzás irányában újabb Stokes-fotonokat váltanak ki. hnL hnS

61 A Stimulált Raman-effektuson alapul több nem-lineáris Raman-spektroszkópiai módszer.
Önmagában nem terjedt el. Csak a legerősebb Raman-átmenetek figyelhetők meg - versengés.

62 Erősítő: nincs küszöb, a teljes spektrumot mérhetjük
oszcillátor n L S generátor tükör "Raman lézer" er ősítő modell gyengül, ősödik Kísérleti megvalósítások Erősítő: nincs küszöb, a teljes spektrumot mérhetjük

63 14.3. Raman erősítési spektroszkópia „Stimulated Raman gain”: nS-t mérjük Inverz Raman: nL-t mérjük
lézer nS nL detektor Dikroikus tükör minta

64 Előny: nem kell monokromátor (az egyik lézert hangoljuk)
Előny: nem kell monokromátor (az egyik lézert hangoljuk). Felbontást a lézerek sávszélessége határozza meg. Inverz Raman: a nagyobb frekv. fényt detektáljuk fluoreszcencia zavarásának kiküszöbölése Felhasználás: nagyfelbontású Raman spektroszkópia

65 5-CB folyadékkristály inverz Raman-színképe

66 Az 5-CB 1606 cm—es inverz Raman jelének intenzitása
négyszögfeszültséget kapcsolva a mintára

67 14.4. Koherens anti-Stokes Raman-spektroszkópia „Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy”
CARS Négy foton vesz részt a folyamatban Kettőt elnyel, kettőt kibocsát a molekula Visszajut a kiind. energiaállapotba.

68 CARS alapkísérlet Imp.lézer folyadék nAS nL nL nL, nS

69 Nómenklatúra: nL  n1 nS  n2 nAS  n3

70 Energia-megmaradás: 2n1 = n2 +n3
Termdiagram n n L AS n n L 2 nS n n n 1 1 3 b a Energia-megmaradás: 2n1 = n2 +n3

71 Indexillesztés: Kondenzált fázisban a törésmutatók különböznek (l függvényében)
Ha kollineáris sugarakat használunk, a jel nagyon gyenge. Impulzus-megmaradás törvényének is teljesülnie kell. Hullámvektor: Hullámszám az anyagban

72 Gázfázisban Folyadék-fázisban

73 A lézersugarakat a mintára fókuszáljuk

74 Berendezés vázlata

75 Spontán Raman és CARS összehasonlítása
foton kell egy szórt foton előállításához foton elég Inkoherens, csak egy részét gyűjtjük össze Koherens, 90 %-os hatás-fokkal összegyűjthető Felbontást a mono-kromátor limitálja Felbontást a lézerek sáv-szélessége limitálja Jel ~ I12·I2·c2 Jel ~ IL·c

76 Spektrumok A kloroform Raman(a) és IR (b) spektruma

77 C60 FT-Raman spektruma

78 Kétatomos molekula rotációs energianívói:
A spektroszkópiában gyakran cm-1-ben fejezik ki az energia-külöbségeket: Itt a fénysebességet cm/s-ban kell behelyettesíteni. B: rotációs konstans

79 J eJ B 2 6B 3 12B 4 20B Kiválasztási szabályok: DJ = 0,  2

80 Kétatomos molekula rotációs energia-nívói és a Raman-átmenetek

81 Kétatomos molekula Raman-spektruma

82 O2 tiszta rotációs inverz Raman-spektruma

83 O2 rezgési-forgási Q-ágának nagyfelbontású Raman-erősítési spektruma

84 SF6 rezgési-forgási Q-ágának nagyfelbontású Raman-erősítési spektruma